Ｎｏｇｇｉｎに対する感受性が低下したＢＭＰ変異体

专利摘要:
本発明は、改変された、非常に強力な骨形成タンパク質を提供する。詳細には、本発明は、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−９が、ＢＭＰサブファミリーのタンパク質の他のメンバーであるＮｏｇｇｉｎによる阻害に対して、感受性がより低いという観察に関する。本発明は、ＢＭＰ−６またはＢＭＰ−９の中央部分が別のＢＭＰサブファミリータンパク質の中央部分を置換して、Ｎｏｇｇｉｎまたは他のＮｏｇｇｉｎ様アンタゴニストによる阻害に対する耐性をもたらしているキメラ骨形成タンパク質を特徴とする。改変ＢＭＰ、組成物および使用方法の他の実施形態も含まれる。
公开号:JP2011507903A
申请号:JP2010539882
申请日:2008-12-19
公开日:2011-03-10
发明作者:ムーレイ；ヒーシャム アラオウイ−イスメイリ，；キニング ソング，
申请人:ストライカー コーポレイションＳｔｒｙｋｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；
IPC主号:C07K14-475

专利说明:

[0001] 関連出願への相互参照
この出願は、２００７年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／００８，７５４号（この内容は、参考として本明細書に援用される）への優先権およびその利益を主張する。]
[0002] 発明の分野
本発明は、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−９が、タンパク質阻害剤Ｎｏｇｇｉｎによる阻害に対して、ＢＭＰサブファミリーの他のメンバーよりも高い耐性を示すとの観察に関する。詳細には、本発明は、ＮｏｇｇｉｎおよびＮｏｇｇｉｎ様タンパク質に対して感受性が低下している、設計または改変された骨形成タンパク質、ならびに上記設計または改変された骨形成タンパク質を利用する組成物の作製および使用方法に関する。]
背景技術

[0003] 骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）のスーパーファミリーに属し、胚パターン形成および組織特化ならびに成体組織で創傷治癒および修復の過程を促進するなどの、細胞および発達の過程の多様なセットを制御する。ＢＭＰは、当初、骨および軟骨の形成を誘導するそれらの能力によって単離された。]
[0004] ＢＭＰは、細胞表面でＩ型およびＩＩ型受容体Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼに結合してそれらを一緒にすることによって、シグナル伝達を開始する。これは、ＩＩ型受容体がＩ型受容体キナーゼをリン酸化することを可能にする。次に、Ｉ型受容体キナーゼは転写因子のＳｍａｄファミリーのメンバーをリン酸化し、Ｓｍａｄは核に移行していくつかの遺伝子の発現を活性化する。ＢＭＰシグナル伝達は骨折および関連する組織損傷後に誘導可能であり、骨再生および修復をもたらす。他方、隣接細胞は、ＢＭＰシグナル伝達に応じて、ＮｏｇｇｉｎおよびＣｈｏｒｄｉｎなどのＢＭＰアンタゴニストを選択的に分泌し、それらがＢＭＰシグナル伝達から逃れるのを可能にする。]
[0005] アンタゴニストはＢＭＰシグナル伝達の空間的調節をもたらす手助けとなり得るが、上記アンタゴニストは一般に細胞外区画に分泌されるので、それらの作用は、それらが分泌される領域を越えて、骨再生部位の近くまたはその部位おけるＢＭＰ活性の低下をもたらし得る。それらのアンタゴニストに対して感受性が低下したＢＭＰ分子は、本来のタンパク質と比較して改善された生物活性を有するであろう。そのような改変ＢＭＰは、組織再生の分野で治療的有用性を有し、現在用いられる治療用量よりも低いタンパク質レベルで強力な活性を提供するであろう。]
発明が解決しようとする課題

[0006] したがって、本発明の目的は、治療使用に適する、設計された非常に強力な骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を提供することである。]
[0007] 本発明の目的は、それらのアンタゴニストによる阻害に対して感受性が低下している、設計されたＢＭＰを提供することである。特に、本発明の目的は、Ｎｏｇｇｉｎおよび／またはＮｏｇｇｉｎ様タンパク質による阻害に対して感受性が低下している、設計されたＢＭＰを提供することである。]
[0008] 本発明のさらなる目的は、本発明の設計されたＢＭＰをコードする核酸配列、および本発明の設計されたＢＭＰを生成するためのそのような核酸配列の使用方法を提供することである。]
課題を解決するための手段

[0009] したがって、一態様では、本発明は、ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質および野生型ＢＭＰ−６のキメラを含むタンパク質であって、野生型ＢＭＰ−６の１つまたは複数のアミノ酸配列が、ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質における対応する残基位置のアミノ酸配列を置換し、キメラはＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質のアンタゴニストによる阻害に耐性であり、ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質の生物活性よりも大きな生物活性を示し、さらに、ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質は野生型ＢＭＰ−６ではないタンパク質を特徴とする。一実施形態では、アンタゴニストは、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ様タンパク質、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／ＤＡＮファミリータンパク質、Ｃｈｏｒｄｉｎ／ＳＯＧファミリータンパク質および上のいずれかの機能的同等物からなる、システインノットタンパク質アンタゴニストの群から選択される。]
[0010] 別の態様では、本発明は、ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質および野生型ＢＭＰ−９のキメラを含むタンパク質であって、野生型ＢＭＰ−９の１つまたは複数のアミノ酸配列が、ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質における対応する残基位置のアミノ酸配列を置換し、キメラはＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質のアンタゴニストによる阻害に耐性であり、ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質の生物活性よりも大きな生物活性を示し、さらに、ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質は野生型ＢＭＰ−９ではないタンパク質を特徴とする。一実施形態では、アンタゴニストは、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ様タンパク質、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／ＤＡＮファミリータンパク質、Ｃｈｏｒｄｉｎ／ＳＯＧファミリータンパク質および上のいずれかの機能的同等物からなる、システインノットタンパク質アンタゴニストの群から選択される。]
[0011] 別の態様では、本発明は、改変骨形成タンパク質（ＢＭＰ）または改変成長分化因子（ＧＤＦ）を含むタンパク質であって、改変ＢＭＰまたはＧＤＦは、対応する未改変の野生型ＢＭＰまたは野生型ＧＤＦよりも、アンタゴニストによって阻害されず、アンタゴニストの存在下で、対応する未改変の野生型ＢＭＰまたはＧＤＦよりも大きな生物活性を有するタンパク質を特徴とする。一実施形態では、アンタゴニストは、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ様タンパク質、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／ＤＡＮファミリータンパク質、Ｃｈｏｒｄｉｎ／ＳＯＧファミリータンパク質および上のいずれかの機能的同等物からなる、システインノットタンパク質アンタゴニストの群から選択される。]
[0012] 別の態様では、本発明はＮｏｇｇｉｎまたはＮｏｇｇｉｎ様タンパク質による阻害に耐性であるタンパク質であって、改変骨形成タンパク質（ＢＭＰ）または改変成長分化因子（ＧＤＦ）を含み、ヒトＢＭＰ−６のＶａｌ４５、Ｇｌｎ４８、Ａｓｐ４９、Ｌｙｓ５０、Ｇｌｎ５３、Ｉｌｅ５７、Ｌｙｓ６０、Ｇｌｙ６１、Ａｌａ６３、Ａｓｎ６５、Ｔｙｒ６６、Ａｓｐ６８、Ｇｌｕ７０、Ｓｅｒ７２、Ａｓｎ７６、Ａｌａ７７、Ｈｉｓ７８、Ｍｅｔ７９およびＡｓｎ８０からなる群より選択される少なくとも３つの置換アミノ酸が、野生型ＢＭＰまたは野生型ＧＤＦにおける対応する位置の少なくとも３つのアミノ酸を置換し、かつ前記少なくとも３つの置換アミノ酸が、前記野生型ＢＭＰまたは前記野生型ＧＤＦにおける対応する位置の前記少なくとも３つのアミノ酸と異なるタンパク質に関する。]
[0013] 別の態様では、本発明はＮｏｇｇｉｎまたはＮｏｇｇｉｎ様タンパク質による阻害に耐性であるタンパク質であって、改変骨形成タンパク質（ＢＭＰ）または改変成長分化因子（ＧＤＦ）を含み、野生型ヒトＢＭＰ−６のＶａｌ４５〜Ａｓｎ８０（配列番号３の残基４５〜８０）が、他の点では野生型のヒトＢＭＰまたはヒトＧＤＦにおける対応するセグメントを置換し、かつ置換された対応するセグメントが、野生型ＢＭＰ−６の前記Ｖａｌ４５〜Ａｓｎ８０と同一ではないタンパク質に関する。]
[0014] 別の態様では、本発明はＮｏｇｇｉｎまたはＮｏｇｇｉｎ様タンパク質による阻害に耐性であるタンパク質であって、改変骨形成タンパク質（ＢＭＰ）または改変成長分化因子（ＧＤＦ）を含み、野生型ヒトＢＭＰ−９のＶａｌ７６〜Ｔｈｒ１１１（配列番号４６の残基７６〜１１１）が、他の点では野生型のヒトＢＭＰまたはヒトＧＤＦにおける対応するセグメントを置換し、かつ置換された対応するセグメントが、野生型ＢＭＰ−９の前記Ｖａｌ７６〜Ｔｈｒ１１１（配列番号４６の残基７６〜１１１）と同一ではないタンパク質に関する。]
[0015] さらに別の態様では、本発明は、Ｄ２２Ｓ、Ｓ２４Ｑ、Ｖ２６Ｌ、Ｎ２９Ｑ、Ｖ３３Ｉ、Ｐ３６Ｋ、Ｈ３９Ａ、Ｆ４１Ｎ、Ｈ４４Ｄ、Ｐ４８Ｓ、Ａ５２Ｎ、Ｄ５３ＡおよびＬ５５Ｍからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む改変ＢＭＰ−２であって、他のすべての残基が、野生型ＢＭＰ−２と同一であるか、または野生型ＢＭＰ−２のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を共有する改変ＢＭＰ−２に関する。]
[0016] さらに別の態様では、本発明は、以下の位置、すなわちＤ２２、Ｓ２４、Ｖ２６、Ｎ２９、Ｖ３３、Ｐ３６、Ｈ３９、Ｆ４１、Ｈ４４、Ｐ４８、Ａ５２、Ｄ５３およびＬ５５の少なくとも１つにおいてアミノ酸置換を含む改変ＢＭＰ−２であって、野生型ＢＭＰ−２のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を共有する改変ＢＭＰ−２に関する。]
[0017] 別の態様では、本発明は、Ｄ２４Ｓ、Ｓ２６Ｑ、Ｖ２８Ｌ、Ｎ３１Ｑ、Ｖ３５Ｉ、Ｐ３８Ｋ、Ｑ４１Ａ、Ｆ４３Ｎ、Ｈ４６Ｄ、Ｄ４８Ｅ、Ｐ５０Ｓ、Ａ５４Ｎ、Ｄ５５ＡおよびＬ５７Ｍからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む改変ＢＭＰ−４であって、他のすべての残基が、野生型ＢＭＰ−４と同一であるか、または野生型ＢＭＰ−４のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を共有する改変ＢＭＰ−４に関する。]
[0018] 別の態様では、本発明は、以下の位置、すなわちＤ２４、Ｓ２６、Ｖ２８、Ｎ３１、Ｖ３５、Ｐ３８、Ｑ４１、Ｆ４３、Ｈ４６、Ｄ４８、Ｐ５０、Ａ５４、Ｄ５５およびＬ５７の少なくとも１つにおいてアミノ酸置換を含む改変ＢＭＰ−４であって、野生型ＢＭＰ−４のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を共有する改変ＢＭＰ−４に関する。]
[0019] 別の態様では、本発明は、Ｒ４１Ｑ、Ｅ５３ＫおよびＦ５８Ｎからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む改変ＢＭＰ−５であって、他のすべての残基が、野生型ＢＭＰ−５と同一であるか、または野生型ＢＭＰ−５のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を共有する改変ＢＭＰ−５に関する。]
[0020] 別の態様では、本発明は、以下の位置、すなわちＲ４１、Ｅ５３およびＦ５８の少なくとも１つにおいてアミノ酸置換を含む改変ＢＭＰ−５であって、野生型ＢＭＰ−５のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を共有する改変ＢＭＰ−５に関する。]
[0021] 別の態様では、本発明は、Ｒ４８Ｑ、Ｅ６０Ｋ、Ｅ６８Ｄ、Ａ７２ＳおよびＳ７７Ａからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む改変ＢＭＰ−７であって、他のすべての残基が、野生型ＢＭＰ−７と同一であるか、または野生型ＢＭＰ−７のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも８９％のアミノ酸配列同一性を共有する改変ＢＭＰ−７に関する。]
[0022] 別の態様では、本発明は、以下の位置、すなわちＲ４８、Ｅ６０、Ｅ６８、Ａ７２およびＳ７７の少なくとも１つにおいてアミノ酸置換を含む改変ＢＭＰ−７であって、野生型ＢＭＰ−７のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも８９％のアミノ酸配列同一性を共有する改変ＢＭＰ−７に関する。]
[0023] 別の態様では、本発明は、Ｒ４８Ｑ、Ｅ６０Ｋ、Ｙ６５Ｎ、Ｅ６８Ｄ、Ａ７２ＳおよびＳ７７Ａからなる群より選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む改変ＢＭＰ−７であって、他のすべての残基が、野生型ＢＭＰ−７と同一であるか、または野生型ＢＭＰ−７のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも８９％のアミノ酸配列同一性を共有する改変ＢＭＰ−７に関する。]
[0024] 別の態様では、本発明は、以下の位置、すなわちＲ４８、Ｅ６０、Ｙ６５、Ｅ６８、Ａ７２およびＳ７７の少なくとも２つにおいてアミノ酸置換を含む改変ＢＭＰ−７であって、野生型ＢＭＰ−７のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも８９％のアミノ酸配列同一性を共有する改変ＢＭＰ−７に関する。]
[0025] 別の態様では、本発明は、Ｒ４８Ｑ、Ｅ６０Ｋ、Ｙ６５Ｎ、Ｅ６８Ｄ、Ａ７２Ｓ、Ｓ７７ＡおよびＹ７８Ｈからなる群より選択される少なくとも３つのアミノ酸置換を含む改変ＢＭＰ−７であって、他のすべての残基が、野生型ＢＭＰ−７と同一であるか、または野生型ＢＭＰ−７のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも８９％のアミノ酸配列同一性を共有する改変ＢＭＰ−７に関する。]
[0026] 別の態様では、本発明は、以下の位置、すなわちＲ４８、Ｅ６０、Ｙ６５、Ｅ６８、Ａ７２、Ｓ７７およびＹ７８の少なくとも３つにおいてアミノ酸置換を含む改変ＢＭＰ−７であって、野生型ＢＭＰ−７のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも８９％のアミノ酸配列同一性を共有する改変ＢＭＰ−７に関する。]
[0027] 別の態様では、本発明は、Ｎ２７Ｓ、Ｋ２９Ｑ、Ｍ３１Ｌ、Ｄ３４Ｑ、Ｌ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｅ４４Ａ、Ｆ４６Ｎ、Ｈ４７Ｙ、Ｅ４９Ｄ、Ｌ５１Ｅ、Ｅ５３Ｓ、Ｒ５７Ｎ、Ｓ５８Ａ、Ｌ６０ＭおよびＥ６１Ｎからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む改変ＧＤＦ−５であって、他のすべての残基が、野生型ＧＤＦ−５と同一であるか、または野生型ＧＤＦ−５のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも８７％のアミノ酸配列同一性を共有する改変ＧＤＦ−５に関する。]
[0028] 別の態様では、本発明は、以下の位置、すなわちＮ２７、Ｋ２９、Ｍ３１、Ｄ３４、Ｌ４１、Ｅ４２、Ｅ４４、Ｆ４６、Ｈ４７、Ｅ４９、Ｌ５１、Ｅ５３、Ｒ５７、Ｓ５８、Ｌ６０およびＥ６１の少なくとも１つにおいてアミノ酸置換を含む改変ＧＤＦ−５であって、他のすべての残基が、野生型ＧＤＦ−５と同一であるか、または野生型ＧＤＦ−５のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも８７％のアミノ酸配列同一性を共有する改変ＧＤＦ−５に関する。]
[0029] 別の態様では、本発明は、Ｎ２７Ｓ、Ｋ２９Ｑ、Ｅ３０Ｄ、Ｄ３４Ｑ、Ｌ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｅ４４Ａ、Ｙ４６Ｎ、Ｈ４７Ｙ、Ｅ４８Ｄ、Ｖ５１Ｅ、Ｄ５３Ｓ、Ｒ５７Ｎ、Ｓ５８Ａ、Ｌ６０ＭおよびＥ６１Ｎからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む改変ＧＤＦ−６であって、他のすべての残基が、野生型ＧＤＦ−６と同一であるか、または野生型ＧＤＦ−６のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも９７％のアミノ酸配列同一性を共有する改変ＧＤＦ−６に関する。]
[0030] 別の態様では、本発明は、以下の位置、すなわちＮ２７、Ｋ２９、Ｅ３０、Ｄ３４、Ｌ４１、Ｅ４２、Ｅ４４、Ｙ４６、Ｈ４７、Ｅ４８、Ｖ５１、Ｄ５３、Ｒ５７、Ｓ５８、Ｌ６０およびＥ６１の少なくとも１つにおいてアミノ酸置換を含む改変ＧＤＦ−６であって、他のすべての残基が、野生型ＧＤＦ−６と同一であるか、または野生型ＧＤＦ−６のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも９７％のアミノ酸配列同一性を共有する改変ＧＤＦ−６に関する。]
[0031] 別の態様では、本発明は、Ｄ３６Ｓ、Ｋ３８Ｑ、Ｅ３９Ｄ、Ｄ４３Ｑ、Ｌ５０Ｋ、Ｄ５１Ｇ、Ｅ５３Ａ、Ｙ５５Ｎ、Ｈ５６Ｙ、Ｅ５８Ｄ、Ｌ６０Ｅ、Ｄ６２Ｓ、Ｒ６６Ｎ、Ｓ６７Ａ、Ｌ６９Ｍおよび／またはＥ７０Ｎからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む改変ＧＤＦ−７であって、他のすべての残基が、野生型ＧＤＦ−７と同一であるか、または野生型ＧＤＦ−７のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも８７％のアミノ酸配列同一性を共有する改変ＧＤＦ−７に関する。]
[0032] 別の態様では、本発明は、以下の位置、すなわちＤ３６Ｓ、Ｋ３８、Ｅ３９、Ｄ４３、Ｌ５０、Ｄ５１、Ｅ５３、Ｙ５５、Ｈ５６、Ｅ５８、Ｌ６０、Ｄ６２、Ｒ６６、Ｓ６７、Ｌ６９および／またはＥ７０の少なくとも１つにおいてアミノ酸置換を含む改変ＧＤＦ−７であって、他のすべての残基が、野生型ＧＤＦ−７と同一であるか、または野生型ＧＤＦ−７のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも８７％のアミノ酸配列同一性を共有する改変ＧＤＦ−７に関する。]
[0033] さらに別の態様では、本発明は、ＮｏｇｇｉｎまたはＮｏｇｇｉｎ様タンパク質による改変骨形成タンパク質（ＢＭＰ）または改変成長分化因子（ＧＤＦ）の阻害を調節するための方法であって、改変骨形成タンパク質（ＢＭＰ）または改変成長分化因子（ＧＤＦ）を提供する工程を含み、ヒトＢＭＰ−６のＶａｌ４５、Ｇｌｎ４８、Ａｓｐ４９、Ｌｙｓ５０、Ｇｌｎ５３、Ｉｌｅ５７、Ｌｙｓ６０、Ｇｌｙ６１、Ａｌａ６３、Ａｓｎ６５、Ｔｙｒ６６、Ａｓｐ６８、Ｇｌｕ７０、Ｓｅｒ７２、Ａｓｎ７６、Ａｌａ７７、Ｍｅｔ７９およびＡｓｎ８０からなる群より選択される少なくとも２つの置換アミノ酸が、野生型ＢＭＰまたは野生型ＧＤＦにおける対応する位置の少なくとも２つのアミノ酸を置換し、かつ前記少なくとも２つの置換アミノ酸が、前記野生型ＢＭＰまたは前記野生型ＧＤＦにおける対応する位置の前記少なくとも２つのアミノ酸と異なり、かつ前記提供する工程が、ＢＭＰまたはＧＤＦの野生型対応物と比較してＮｏｇｇｉｎまたはＮｏｇｇｉｎ様タンパク質による前記ＢＭＰまたはＧＤＦの阻害の調節をもたらす方法に関する。]
[0034] 別の態様では、本発明は、ＮｏｇｇｉｎまたはＮｏｇｇｉｎ様タンパク質による骨形成タンパク質（ＢＭＰ）または成長分化因子（ＧＤＦ）の阻害を調節するための方法であって、改変ＢＭＰまたはＧＤＦタンパク質を提供する工程であり、前記改変タンパク質は、ヒトＢＭＰまたはヒトＧＤＦにおける対応するセグメントを野生型ヒトＢＭＰ−６のＶａｌ４５〜Ａｓｎ８０（配列番号３の残基４５〜８０）で置換することから生成される工程を含み、置換された対応するセグメントは、野生型ＢＭＰ−６の前記Ｖａｌ４５〜Ａｓｎ８０と同一でなく、前記提供する工程は、ＢＭＰまたはＧＤＦの野生型対応物と比較してＮｏｇｇｉｎまたはＮｏｇｇｉｎ様タンパク質による前記ＢＭＰまたはＧＤＦの阻害の調節をもたらす方法に関する。]
[0035] 別の態様では、本発明は、野生型のＢＭＰまたはＧＤＦタンパク質に対応するＮ末端アミノ酸配列およびＣ末端アミノ酸配列を含む天然に存在しないペプチドであって、前記天然に存在しないペプチドのＮ末端アミノ酸配列およびＣ末端アミノ酸配列の各々が、野生型のＢＭＰまたはＧＤＦタンパク質と少なくとも９７％のアミノ酸配列同一性を共有し、かつ前記ＢＭＰはＢＭＰ−６でないという条件で、前記天然に存在しないペプチドが、Ｖａｌ４５、Ｓｅｒ４６、Ｇｌｎ４８、Ａｓｐ４９、Ｌｙｓ５０、Ｇｌｎ５３、Ｉｌｅ５７、Ｌｙｓ６０、Ｇｌｙ６１、Ａｌａ６３、Ａｓｎ６５、Ｔｙｒ６６、Ａｓｐ６８、Ｇｌｕ７０、Ｓｅｒ７２、Ａｓｎ７６、Ａｌａ７７、Ｍｅｔ７９およびＡｓｎ８０からなる群より選択されるＢＭＰ−６アミノ酸残基に対応する位置の少なくとも２つのアミノ酸残基を有する、天然に存在しないペプチドに関する。一実施形態では、天然に存在しないペプチドのＮ末端またはＣ末端のアミノ酸配列が、野生型のＢＭＰまたはＧＤＦタンパク質と同一である。別の実施形態では、天然に存在しないペプチドが、その野生型のＢＭＰまたはＧＤＦ対応物と比較して、ＮｏｇｇｉｎまたはＮｏｇｇｉｎ様タンパク質による生物活性阻害の低減を示す。さらに別の実施形態では、本発明は、天然に存在しないペプチドを、薬学的に許容される担体と混合されて含む医薬組成物を提供する。]
[0036] さらに別の態様では、本発明は、ＮｏｇｇｉｎまたはＮｏｇｇｉｎ様タンパク質による改変骨形成タンパク質（ＢＭＰ）または改変成長分化因子（ＧＤＦ）の阻害を調節するための方法であって、改変骨形成タンパク質（ＢＭＰ）または改変成長分化因子（ＧＤＦ）を提供する工程を含み、ヒトＢＭＰ−９のＡｓｎ７７、Ｇｌｕ７９、Ｉｌｅ８１、Ａｓｐ８４、Ｓｅｒ８５、Ｉｌｅ８８、Ｌｙｓ９１、Ｇｌｕ９２、Ｇｌｕ９４、Ｔｙｒ９６、Ｇｌｕ９７、Ｌｙｓ９９、Ｇｌｙ１０１、Ｐｈｅ１０３、Ａｌａ１０７、Ａｓｐ１０８、Ａｓｐ１０９、Ｖａｌ１１０またはＴｈｒ１１１からなる群より選択される少なくとも２つの置換アミノ酸が、野生型ＢＭＰまたは野生型ＧＤＦにおける対応する位置の少なくとも２つのアミノ酸を置換し、かつ前記少なくとも２つの置換アミノ酸が、前記野生型ＢＭＰまたは前記野生型ＧＤＦにおける対応する位置の前記少なくとも２つのアミノ酸と異なり、かつ前記提供する工程が、ＢＭＰまたはＧＤＦの野生型対応物と比較して、ＮｏｇｇｉｎまたはＮｏｇｇｉｎ様タンパク質による前記ＢＭＰまたはＧＤＦの阻害の調節をもたらす方法に関する。]
[0037] 別の態様では、本発明は、ＮｏｇｇｉｎまたはＮｏｇｇｉｎ様タンパク質による骨形成タンパク質（ＢＭＰ）または成長分化因子（ＧＤＦ）の阻害を調節するための方法であって、改変ＢＭＰまたはＧＤＦタンパク質を提供する工程であり、前記改変タンパク質は、ヒトＢＭＰまたはヒトＧＤＦにおける対応するセグメントを野生型ヒトＢＭＰ−９のＶａｌ７６〜Ｔｈｒ１１１で置換することから生成される工程を含み、置換された対応するセグメントは、野生型ＢＭＰ−９の前記Ｖａｌ７６〜Ｔｈｒ１１１と同一でなく、前記提供する工程は、ＢＭＰまたはＧＤＦの野生型対応物と比較してＮｏｇｇｉｎまたはＮｏｇｇｉｎ様タンパク質による前記ＢＭＰまたはＧＤＦの阻害の調節をもたらす方法に関する。]
[0038] 別の態様では、本発明は、野生型のＢＭＰまたはＧＤＦタンパク質に対応するＮ末端アミノ酸配列およびＣ末端アミノ酸配列を含む天然に存在しないペプチドであって、前記天然に存在しないペプチドのＮ末端アミノ酸配列およびＣ末端アミノ酸配列の各々が、野生型のＢＭＰまたはＧＤＦタンパク質と少なくとも９７％のアミノ酸配列同一性を共有し、さらに前記ＢＭＰはＢＭＰ−９でないという条件で、前記天然に存在しないペプチドが、Ａｓｎ７７、Ｇｌｕ７９、Ｉｌｅ８１、Ａｓｐ８４、Ｓｅｒ８５、Ｉｌｅ８８、Ｌｙｓ９１、Ｇｌｕ９２、Ｇｌｕ９４、Ｔｙｒ９６、Ｇｌｕ９７、Ｌｙｓ９９、Ｇｌｙ１０１、Ｐｈｅ１０３、Ａｌａ１０７、Ａｓｐ１０８、Ａｓｐ１０９、Ｖａｌ１１０またはＴｈｒ１１１からなる群より選択されるＢＭＰ−９アミノ酸残基に対応する位置の少なくとも２つのアミノ酸残基を有する、天然に存在しないペプチドに関する。一実施形態では、天然に存在しないペプチドのＮ末端アミノ酸配列またはＣ末端アミノ酸配列は、野生型のＢＭＰまたはＧＤＦタンパク質と同一である。別の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、その野生型のＢＭＰまたはＧＤＦ対応物と比較して、ＮｏｇｇｉｎまたはＮｏｇｇｉｎ様タンパク質による生物活性阻害の低減を示す。]
[0039] さらに別の実施形態では、本発明は、天然に存在しないペプチドを、薬学的に許容される担体と混合されて含む医薬組成物を提供する。]
[0040] さらに別の実施形態では、本発明は、本発明の改変ＢＭＰまたはＧＤＦタンパク質をコードする核酸を提供する。]
[0041] 本発明の他の特徴、目的および利点は、後の「発明を実施するための形態」で明らかである。しかし、「発明を実施するための形態」は本発明の実施形態を示すが、例示のためだけに与えられるもので、限定するものではない。本発明の範囲内の様々な変更および修正は、「発明を実施するための形態」から当業者には明らかとなる。]
[0042] 図は、限定のためではなく、例示のために提供される。]
図面の簡単な説明

[0043] 成熟ヒトＢＭＰ−７タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。
成熟ヒトＢＭＰ−２タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。
成熟ヒトＢＭＰ−６タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）を示す図である。
成熟ヒトＢＭＰ−４タンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）を示す図である。
成熟ヒトＢＭＰ−５タンパク質のアミノ酸配列（配列番号５）を示す図である。
成熟ヒトＧＤＦ−５タンパク質のアミノ酸配列（配列番号６）を示す図である。
成熟ヒトＧＤＦ−６タンパク質のアミノ酸配列を（配列番号７）示す図である。
成熟ヒトＧＤＦ−７タンパク質のアミノ酸配列（配列番号８）を示す図である。
ＢＭＰおよびＴＧＦ−βシグナル伝達の機構の概略図である。そこで示すように、リガンドとの結合後、２つの型のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ受容体の特異的対は、１つはＩ型および他はＩＩ型にヘテロ二量体化する。次に、ＩＩ型キナーゼはヘテロ二量体化後にＩ型受容体キナーゼをリン酸化し、Ｉ型受容体キナーゼが、シグナル伝達のためにＡＴＰおよびＳｍａｄタンパク質基質に結合することを可能にする。リガンドは、シグナル伝達経路に従って３つの群（アビジン、ＴＧＦ−βおよびＢＭＰ）に、または配列類似性および結合様式に従って２つの群（ＴＧＦ−β／アビジン、およびＢＭＰ）に分類することができる。
ＢＭＰ−７−Ｎｏｇｇｉｎ構造複合体を表す図である。そこで示すように、ＢＭＰ−７上のｎｏｇｇｉｎ結合部位は、Ｉ型およびＩＩ型両受容体結合部位にまたがる。Ｎｏｇｇｉｎ複合体は、黒のストライプ（右）および灰色のストライプ（左）で表され、ＢＭＰ−７複合体は、白色（右）および点（左）で表される。
ＲＯＳアルカリホスファターゼアッセイにおけるＮｏｇｇｉｎに対するＢＭＰの感受性の比較分析を示す図である。Ｎｏｇｇｉｎによるいくつかの例示的なＢＭＰファミリーメンバーの阻害割合を表す。ＢＭＰ−６は、Ｎｏｇｇｉｎによる阻害に最も低感受性である。
図１２Ａは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおけるＮｏｇｇｉｎに対するＢＭＰの感受性の比較分析を示す図である。Ａ−５４９−ＢＲＥ細胞でのＢＭＰ誘導ルシフェラーゼ阻害によって測定された、Ｎｏｇｇｉｎによるいくつかの例示的なＢＭＰおよびＧＤＦファミリーメンバーの阻害割合を表す。ＢＭＰ−６はＮｏｇｇｉｎによる阻害に最も低感受性であり、それにＢＭＰ−７、次いでＢＭＰ−２が続き、ＢＭＰ−４がＮｏｇｇｉｎによる阻害に最も高感受性である。図１２Ｂは、ＱＰＣＲに基づくＩＤ−１遺伝子発現アッセイにおけるＮｏｇｇｉｎに対するＢＭＰの感受性の比較分析を示す図である。Ｎｏｇｇｉｎの存在下または非存在下での、いくつかの例示的なＢＭＰファミリーメンバーによるヒト骨髄由来間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）の処理の後の、ＩＤ−１ｍＲＮＡの相対量（ＲＱ）を表す。ＢＭＰ−６はＮｏｇｇｉｎによる阻害に最も低感受性であり、それにＢＭＰ−７、次いでＢＭＰ−２が続き、ＢＭＰ−４がＮｏｇｇｉｎによる阻害に最も高感受性である。
ＢＭＰ−６のどの領域がＮｏｇｇｉｎに対する感受性の低下にとって重要であるかについて判断するために作製された、ＢＭＰ−６／ＢＭＰ−７キメラを示す図である。第一のキメラでは、ＢＭＰ−７のアミノ酸１〜４０（配列番号１の残基１〜４０）は、ＢＭＰ−６の対応するアミノ酸で置換された。第二のキメラでは、ＢＭＰ−７のアミノ酸４５〜８０（配列番号１の残基４５〜８０）は、ＢＭＰ−６の対応するアミノ酸で置換された。第三のキメラでは、ＢＭＰ−７のアミノ酸９０〜１２０（配列番号１の残基９０〜１２０）は、ＢＭＰ−６の対応するアミノ酸で置換された。
野生型ＢＭＰ−６および野生型ＢＭＰ−７ならびに３つのＢＭＰ−６／ＢＭＰ−７キメラに対するＮｏｇｇｉｎの異なる濃度（低濃度Ｎ１、中濃度Ｎ２および高濃度Ｎ３）による阻害の程度を示す図である。「４０−１」は、ＢＭＰ−６のアミノ酸１〜４０（配列番号３の残基１〜４０）がＢＭＰ−７の対応するアミノ酸を置換したキメラを示す。「８０−１」は、ＢＭＰ−６のアミノ酸４５〜８０（配列番号３の残基４５〜８０）がＢＭＰ−７の対応するアミノ酸を置換したキメラを示す。「９０−１」は、ＢＭＰ−６のアミノ酸９０〜１２０（配列番号３の残基９０〜１２０）がＢＭＰ−７の対応するアミノ酸を置換したキメラを示す。試験したキメラの中で、キメラ「８０−１」が、Ｎｏｇｇｉｎ阻害に最も耐性である。
成熟したＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６およびＧＤＦ−７のタンパク質配列のアラインメントを示す図である。
成熟したＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７およびＢＭＰ−５のタンパク質配列のアラインメントを示す図である。
成熟したＢＭＰ−６、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４のタンパク質配列のアラインメントを示す図である。
成熟したＢＭＰ−７の好ましいアミノ酸置換の位置を表す図である。すべての置換の存在を、配列番号９に表す。
成熟したＢＭＰ−５の好ましいアミノ酸置換の位置を表す図である。すべての置換の存在を、配列番号１０に表す。
図２０Ａは、ＢＭＰ−６とＢＭＰ−２との間のアミノ酸差の位置を表す図である。それらは、成熟ＢＭＰ−２のアミノ酸置換の好ましい位置でもある。すべての置換をＢＭＰ−２に加える場合、生じる配列を配列番号１１に表す。図２０Ｂは、図２０Ａに表すアミノ酸差を表す図である。それらについては、ＢＭＰ−７もＢＭＰ−６と異なる。これらは、ＢＭＰ−２の置換の最も好ましい位置である。すべての好ましい置換を加える場合、生じる配列を配列番号１２に表す。
図２１Ａは、ＢＭＰ−６とＢＭＰ−４との間のアミノ酸差の位置を表す図である。それらは、成熟ＢＭＰ−４のアミノ酸置換の好ましい位置でもある。すべての好ましい置換を加える場合、生じる配列を配列番号１３に表す。図２１Ｂは、図２１Ａに表すアミノ酸差を表す図である。それらについては、ＢＭＰ−７もＢＭＰ−６と異なる。これらは、成熟ＢＭＰ−４のアミノ酸置換の最も好ましい位置である。すべての好ましい置換を加える場合、生じる配列を配列番号１４に表す。
図２２Ａは、ＢＭＰ−６とＧＤＦ−５との間のアミノ酸差の位置を表す図である。それらは、成熟ＧＤＦ−５のアミノ酸置換の好ましい位置でもある。すべての好ましい置換を加える場合、生じる配列を配列番号１５に表す。図２２Ｂは、図２２Ａに表すアミノ酸差を表す図である。それらについては、ＢＭＰ−７もＢＭＰ−６と異なる。これらは、成熟ＧＤＦ−５のアミノ酸置換の最も好ましい位置である。すべての好ましい置換を加える場合、生じる配列を配列番号１６に表す。
図２３Ａは、ＢＭＰ−６とＧＤＦ−６との間のアミノ酸差の位置を表す図である。それらは、成熟ＧＤＦ−６のアミノ酸置換の好ましい位置でもある。すべての好ましい置換を加える場合、生じる配列を配列番号１７に表す。図２３Ｂは、図２３Ａに表すアミノ酸差を表す図である。それらについては、ＢＭＰ−７もＢＭＰ−６と異なる。これらは、成熟ＧＤＦ−６のアミノ酸置換の最も好ましい位置である。すべての好ましい置換を加える場合、生じる配列を配列番号１８に表す。
図２４Ａは、ＢＭＰ−６とＧＤＦ−７との間のアミノ酸差の位置を表す図である。それらは、成熟ＧＤＦ−７のアミノ酸置換の好ましい位置でもある。すべての好ましい置換を加える場合、生じる配列を配列番号１９に表す。図２４Ｂは、図２４Ａに表すアミノ酸差を表す図である。それらについては、ＢＭＰ−７もＢＭＰ−６と異なる。これらは、成熟ＧＤＦ−７のアミノ酸置換の最も好ましい位置である。すべての好ましい置換を加える場合、生じる配列を配列番号２０に表す。
様々な成長因子で処理した後の、ＲＯＳ１７／２．８細胞の用量依存的アルカリホスファターゼ活性を表す図である。
ＲＯＳ１７／２．８細胞でアルカリホスファターゼ活性を誘導することにおける、様々な成長因子のＥＣ５０値を表す図である。値は、試料の平均光学濃度の非線形回帰から導いた。様々な成長因子の活性の阻害についてのｎｏｇｇｉｎのＩＣ５０値も、提供される。
Ｎｏｇｇｉｎの存在下または非存在下でのＢＭＰ−６またはＢＭＰ−７タンパク質によるｈＭＳＣの処理に応じる、定量ＰＣＲによって測定された、Ｉｄ−１、ｄｌｘ−５、Ｓｐ−７、ｍｓｘ−２、ｎｏｇｇｉｎおよびアルカリホスファターゼ遺伝子の転写産物の発現レベルを表す棒グラフである。ＢＭＰ−６は、Ｎｏｇｇｉｎ阻害に対してＢＭＰ−７よりも耐性である。
ｎｏｇｇｉｎの濃度の関数としての、精製されたＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７およびＢＭＰ−７変異体「８０−１」の阻害割合を表す線グラフである。キメラ「８０−１」は、Ｎｏｇｇｉｎに対して野生型ＢＭＰ−７よりも耐性である。野生型ＢＭＰ−６およびキメラ「８０−１」のＮｏｇｇｉｎ耐性は同等である。
図２９Ａは、野生型ＢＭＰ−７（配列番号１の残基４８〜４８）およびＢＭＰ−７「８０−１」突然変異体（配列番号３２）の位置４８〜７８の間の、これらの２つのタンパク質の間で異なるアミノ酸残基を表す図である。また、ＢＭＰ−７復帰突然変異体ＲＥＶＱ４８Ｒ（配列番号３３）、ＲＥＶＫ６０Ｅ（配列番号３４）、ＲＥＶＮ６５Ｙ（配列番号３５）、ＲＥＶＤ６８Ｅ（配列番号３６）、ＲＥＶＳ７２Ａ（配列番号３７）、ＲＥＶＡ７７Ｓ（配列番号３８）およびＲＥＶＨ７８Ｙ（配列番号３９）を作製するために、特定の残基を野生型ＢＭＰ−７で見出されるものに復帰させるためにＢＭＰ−７「８０−１」突然変異体で起こさせた点突然変異も表す。また、１００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌおよび１０００ｍｇ／ｍｌの３つの濃度のｎｏｇｇｉｎの存在下での、これらの突然変異体の相対活性も示す。図２９Ｂは、前に図２９Ａで表したように１００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌおよび１０００ｍｇ／ｍｌの３つの濃度のｎｏｇｇｉｎの存在下での、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、「８０−１」および図２９Ａで挙げた復帰突然変異体の相対活性を示す棒グラフである。
図３０Ａは、ＢＭＰ−７の位置４８〜７８（配列番号１の残基４８〜７８）のアミノ酸残基およびＢＭＰ−６のそれらの対応する残基を表す図である。ＢＭＰ−７突然変異体ＢＭＰ−７ Ｅ６０Ｋ（配列番号２１）、ＢＭＰ−７ Ｙ６５Ｎ（配列番号３０）、ＢＭＰ−７ Ｙ７８Ｈ（配列番号３２）およびＢＭＰ−７ Ｒ４８Ｑ／Ｅ６０Ｋ／Ｙ６５Ｎ（配列番号２５）を作製するためにＢＭＰ−７配列に起こさせた点突然変異を表す。また、１００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌおよび１０００ｍｇ／ｍｌの３つの濃度のｎｏｇｇｉｎの存在下での、これらの突然変異体の相対活性も示す。図３０Ｂは、前に図３０Ａで表したように１００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌおよび１０００ｍｇ／ｍｌの３つの濃度のｎｏｇｇｉｎの存在下での、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、および図３０Ａで挙げたＢＭＰ−７突然変異体の相対活性を示す棒グラフである。
図３１Ａは、ヒトＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−７およびＢＭＰ−９の各々の、ヒトＢＭＰ−６の残基４９〜７３に対応する部分のアラインメントを示す図である。図３１Ｂは、１００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌおよび１０００ｎｇ／ｍｌの３つの濃度のｎｏｇｇｉｎの存在下での、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７および精製されたＢＭＰ−７ Ｅ６０Ｋ突然変異体の相対活性を表す棒グラフである。図３１Ｃは、１００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌおよび１０００ｎｇ／ｍｌの３つの濃度のｎｏｇｇｉｎの存在下での、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−２、およびＢＭＰ−２ Ｐ３６Ｋ突然変異体の相対活性を表す棒グラフである。
ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７の位置４８〜７８の間で異なるアミノ酸残基を示す図である。ＢＭＰ−７突然変異体ＢＭＰ−７ Ｒ４８Ｑ／Ｓ７７Ａ（配列番号２２）、ＢＭＰ−７ Ｒ４８Ｑ／Ｅ６０Ｋ（配列番号２３）、ＢＭＰ−７ Ｒ４８Ｑ／Ｅ６０Ｋ／Ｓ７７Ａ（配列番号２４）、ＢＭＰ−７ Ｒ４８Ｑ／Ｅ６０Ｋ／Ｙ６５Ｎ（配列番号２５）、ＢＭＰ−７ Ｅ６０Ｋ／Ｙ６５Ｎ（配列番号２６）、ＢＭＰ−７ Ｅ６０Ｋ／Ｙ６５Ｎ／Ａ７２Ｓ（配列番号２７）、ＢＭＰ−７ Ｒ４８Ｋ／Ｅ６０Ｋ／Ｙ６５Ｎ／Ａ７２Ｓ（配列番号２８）およびＢＭＰ−７ Ｙ６５Ｎ／Ｙ７８Ｈ（配列番号２９）を作製するために必要とされる点突然変異を表す。
作製された様々なＢＭＰ−７突然変異体のサブセット、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞でのそれらの発現レベル、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ（本明細書で記載される）におけるそれらの活性レベル、およびｎｏｇｇｉｎの存在下でのそれらの阻害レベルを表す図である。
１００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌおよび１０００ｎｇ／ｍｌの３つの濃度のｎｏｇｇｉｎの存在下での、様々なＢＭＰ−７突然変異体の阻害割合を示す棒グラフである。
成熟ＢＭＰ−９タンパク質のアミノ酸配列を示す図である。] 図１２Ａ 図１２Ｂ 図２０Ａ 図２０Ｂ 図２１Ａ 図２１Ｂ 図２２Ａ 図２２Ｂ 図２３Ａ 図２３Ｂ
[0044] 本発明は、ＢＭＰシグナル伝達に関して改善された特性を有する、設計または改変ＢＭＰを提供する。本発明は、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−９のそれぞれが、タンパク質阻害剤Ｎｏｇｇｉｎによる阻害に対して、ＢＭＰおよびＧＤＦファミリーの他のメンバーよりも高い耐性を示すとの観察に関する。詳細には、本発明は、ＮｏｇｇｉｎおよびＮｏｇｇｉｎ様タンパク質に対して感受性が低下している、設計または改変骨形成タンパク質、ならびに、設計または改変骨形成タンパク質を利用する組成物の作製および使用方法に関する。さらに別の態様では、本発明は、本発明の改変ＢＭＰを含む治療組成物を提供する。したがって、本発明は、ＢＭＰ治療法のかなりの進歩を表す。]
[0045] 本発明の様々な態様が、以下のサブセクションでさらに詳細に記載される。サブセクションの使用は、本発明を限定するものではない。各サブセクションは、本発明の任意の態様に適用することができる。
骨形成タンパク質
ＢＭＰは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する。ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質は、６個の保存されたシステイン残基を特徴とするサイトカインである（Ｌａｎｄｅｒら、（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ、４０９巻：８６０〜９２１頁）。ヒトゲノムは、ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質をコードする約４２のオープンリーディングフレームを含む。ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質は、配列類似性およびそれらが活性化する特定のシグナル伝達経路に基づいて、少なくともＢＭＰサブファミリーおよびＴＧＦ−βサブファミリーに分類することができる。ＢＭＰサブファミリーには、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３（オステオゲニン）、ＢＭＰ−３ｂ（ＧＤＦ−１０）、ＢＭＰ−４（ＢＭＰ−２ｂ）、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７（骨形成タンパク質−１またはＯＰ−１）、ＢＭＰ−８（ＯＰ−２）、ＢＭＰ−８Ｂ（ＯＰ−３）、ＢＭＰ−９（ＧＤＦ−２）、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１（ＧＤＦ−１１）、ＢＭＰ−１２（ＧＤＦ−７）、ＢＭＰ−１３（ＧＤＦ−６、ＣＤＭＰ−２）、ＢＭＰ−１５（ＧＤＦ−９）、ＢＭＰ−１６、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５（ＣＤＭＰ−１）およびＧＤＦ−８（ミオスタチン）が含まれるが、これらに限定されない。ＢＭＰは、骨形成タンパク質（ＯＰ）、成長分化因子（ＧＤＦ）または軟骨由来形態形成タンパク質（ＣＤＭＰ）と呼ばれることもある。ＢＭＰは、他の動物種にも存在する。さらに、ヒト集団の異なるメンバー間で、ＢＭＰ配列に多少の対立遺伝子変異が存在する。本明細書で用いるように、特に別途指示されない限り、「ＢＭＰサブファミリー」、「ＢＭＰ」、「ＢＭＰリガンド」およびそれらの文法同等物は、ＢＭＰサブファミリーメンバーを指す。]
[0046] ＴＧＦ−βサブファミリーには、ＴＧＦ（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３）、アクチビン（例えば、アクチビンＡ）およびインヒビン、マクロファージ阻害のサイトカイン−１（ＭＩＣ−１）、ミュラー阻害物質、抗ミュラー管ホルモンおよびグリア細胞系由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で用いるように、特に別途指示されない限り、「ＴＧＦ−βサブファミリー」、「ＴＧＦ−β」、「ＴＧＦ−βリガンド」およびその文法の同等物はＴＧＦ−βサブファミリーメンバーを指す。]
[0047] ＴＧＦ−βスーパーファミリーは、それに代わってシステインノットサイトカインスーパーファミリーのサブセットである。システインノットサイトカインスーパーファミリーの追加メンバーには、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、Ｎｏｇｇｉｎ、ニューロトロフィン（ＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＮＴ４およびβＮＧＦ）、ゴナドトロピン、フォリトロピン、ルトロピン、インターロイキン−１７およびコアグロゲンが含まれるが、これらに限定されない。]
[0048] 構造的に、ＢＭＰは二量体システインノットタンパク質である。各ＢＭＰモノマーは、複数の分子内ジスルフィド結合を含む。さらなる分子間ジスルフィド結合が、ほとんどのＢＭＰで二量体化を媒介する。ＢＭＰは、ホモダイマーを形成することができる。一部のＢＭＰは、ヘテロダイマーを形成することができる。]
[0049] ＢＭＰは、本来、長いプロドメイン、１つまたは複数の切断部位、および成熟したドメインを含むプロタンパク質として発現される。その後、このプロタンパク質は細胞機構によって加工され、二量体成熟ＢＭＰ分子を産する。プロドメインは、ＢＭＰの正しい折畳みおよびプロセシングを助けると考えられている。さらに、すべてでなくいくつかのＢＭＰでは、プロドメインは成熟ドメインに非共有結合的に結合することができ、シャペロンならびに阻害剤として作用することができる（例えば、Ｔｈｉｅｓら（２００１年）Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、１８巻：２５１〜２５９頁）。]
[0050] ＢＭＰ二量体が２つのＩ型および２つのＩＩ型セリン／トレオニンキナーゼ受容体に結合するときに、ＢＭＰシグナル伝達が開始される。Ｉ型受容体には、ＡＬＫ−１、ＡＬＫ−２（ＡｃｔＲＩａまたはＡｃｔＲＩとも呼ばれる）、ＡＬＫ−３（ＢＭＰＲＩａとも呼ばれる）およびＡＬＫ−６（ＢＭＰＲＩｂとも呼ばれる）が含まれるが、これらに限定されない。ＩＩ型受容体には、ＡｃｔＲＩＩａ（ＡｃｔＲＩＩとも呼ばれる）、ＡｃｔＲＩＩｂおよびＢＭＰＲＩＩが含まれるが、これらに限定されない。ヒトゲノムは、受容体セリン／トレオニンキナーゼファミリーの１２個のメンバーを含み、それらには、７つのＩ型および５つのＩＩ型受容体が含まれ、そのすべてはＴＧＦ−βシグナル伝達に関与する（Ｍａｎｎｉｎｇら、（２００２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９８巻：１９１２〜１９３４頁、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。ＢＭＰ結合に続いて、ＩＩ型受容体はＩ型受容体をリン酸化し、Ｉ型受容体は転写因子のＳｍａｄファミリーのメンバーをリン酸化し、Ｓｍａｄは核に移行していくつかの遺伝子の発現を活性化する。ＢＭＰおよびＴＧＦ−βシグナル伝達の機構は、図９でさらに図示する。] 図９
[0051] ＢＭＰは阻害剤、溶解性受容体およびデコイ受容体とも相互作用し、その例には、それらに限定されないが、ＢＡＭＢＩ（ＢＭＰおよびアクチビン膜結合阻害剤）、ＢＭＰＥＲ（ＢＭＰ結合性内皮細胞前駆体由来の調節因子）、セルベルス（Ｃｅｒｂｅｒｕｓ）、コーディン（ｃｏｒｄｉｎ）、コーディン様、ダン（Ｄａｎ）、ダンテ（Ｄａｎｔｅ）、フォリスタチン、フォリスタチン関連タンパク質（ＦＳＲＰ）、エクトジン（ｅｃｔｏｄｉｎ）、グレムリン、Ｎｏｇｇｉｎ、ダン（Ｄａｎ）およびセルベルス関連タンパク質（ＰＲＤＣ）、スクレロスチン（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）、スクレロスチン様、ＳＯＧ、および子宮感作関連遺伝子−１（ＵＳＡＧ−１）が含まれる。さらに、ＢＭＰは共受容体と相互作用することができ、例えば、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４は共受容体ドラゴン（ＤＲＡＧＯＮ）（Ｓａｍａｄら（２００５年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２８０巻：１４１２２〜９頁）、ならびに硫酸ヘパリンおよびヘパリンなどの細胞外マトリックス成分（Ｉｒｉｅら（２００３年）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、３０８巻：８５８〜８６５頁）に結合する。
ＢＭＰとそれらのアンタゴニストとの間の相互作用
Ｎｏｇｇｉｎのような溶解性ＢＭＰアンタゴニストは、ＢＭＰに結合することができる。ＢＭＰ上のＮｏｇｇｉｎ結合部位は、Ｉ型およびＩＩ型両方の受容体の結合部位と重なる。例えば、ＢＭＰ−７−Ｎｏｇｇｉｎ複合体を、図１０に図示する。さらに、ＢＭＰ−７へのＮｏｇｇｉｎ結合は、ＢＭＰ−７がその受容体に結合することおよび／またはそれを活性化することを阻止し得るであろうＢＭＰ−７の立体配座変化を誘導する。ＮｏｇｇｉｎのようなＤＡＮファミリーアンタゴニストは、システインノットタンパク質ファミリーのメンバーである。ＤＡＮファミリータンパク質およびＮｏｇｇｉｎはこの構造モチーフを共有するので、それらは類似した方法でＢＭＰに結合し得るであろう。コーディン（Ｃｈｏｒｄｉｎ）／ＳＯＧアンタゴニストは、同様の方法でＢＭＰに結合すると提案されている。したがって、本発明は、Ｎｏｇｇｉｎおよび／または他のＮｏｇｇｉｎ様アンタゴニストによる阻害を逃れることができるＢＭＰタンパク質を設計することを企図する。] 図１０
[0052] ＮｏｇｇｉｎのようなＢＭＰアンタゴニストは、発達の過程でのＢＭＰシグナル伝達を消去および制限するために重要であり得るであろう。ＢＭＰアンタゴニストは、勾配を通して空間調節を提供し得るであろう。成体の脳室下ゾーンの幹細胞での、適切な背腹パターニング、骨格形成およびニューロン分化のために、多少のレベルのアンタゴニスト作用が必要である。しかし、これらのアンタゴニストは細胞外区画に分泌されるので、それらの作用はそれらが分泌される場所を越えることができ、そのことは、ＢＭＰシグナル伝達の効力を不幸にも低下させるであろう。本発明は、ＮｏｇｇｉｎなどのＢＭＰアンタゴニストによる阻害に対するそれらの感受性を低下させることによって、ＢＭＰの効力を高めることを企図する。Ｎｏｇｇｉｎ機能を阻害することは、ＢＭＰの生物活性を増加させ得るであろう。それは、骨の形成もしくは修復を高め、神経芽細胞が増殖することができる神経微小環境をもたらすことができるであろう。本明細書で用いるように、用語「生物活性」は、インビボまたはインビトロでのＢＭＰの任意の測定可能な機能を指す。ＢＭＰの生物活性を測定することができる方法のいくつかを、下の「実施例」のセクションに記載する。]
[0053] Ｎｏｇｇｉｎは、それが他のＢＭＰを阻害するのと同じ程度には、ＢＭＰ−６またはＢＭＰ−９を阻害しない（例えば、図１１、１２Ａ、１２Ｂおよび図３１Ｂを参照）。Ｎｏｇｇｉｎに対する感受性の低下に重要なＢＭＰ−６の領域は、Ｖａｌ４５〜Ａｓｎ８０の領域である。ＢＭＰ−６のＶａｌ４５〜Ａｓｎ８０がＢＭＰ−７の対応する領域を置換する改変タンパク質が作製されると、生じる改変タンパク質はＮｏｇｇｉｎによる阻害に耐性である。ＢＭＰ−９のＶａｌ７６〜Ｔｈｒ１１１のＢＭＰ−９領域がＢＭＰ−７の対応する領域を置換し、Ｎｏｇｇｉｎによる阻害に耐性である改変タンパク質をもたらすことができることも考えられる。本明細書で用いるように、用語「対応する領域」、「対応する部分」、「対応するアミノ酸（複数可）」、「対応する残基（複数可）」または「対応するアミノ酸配列（複数可）」は、それら２つのタンパク質を当分野の技術者に公知であるいくつかのアラインメントアルゴリズムのいずれかに基づいてアラインメントさせる場合、所与のＢＭＰサブファミリーメンバーの、ＢＭＰ−６またはＢＭＰ−９の関連するアミノ酸とアラインメントする、またはその逆の、１つまたは複数のアミノ酸を指す。また、本明細書で用いるように、用語「中央の領域」または「中央の部分」または「中央のセグメント」は、ＢＭＰ−６のＶａｌ４５〜Ａｓｎ８０を、または別のＢＭＰサブファミリーメンバーの対応する領域を指す。ＢＭＰ−６およびいくつかのＢＭＰサブファミリーメンバーの代表的なアラインメントは、図１５、１６および１７で見ることができる。他のＢＭＰサブファミリーメンバーの対応する部分とのＢＭＰ−９の部分のアラインメントは、図３１Ａで見ることができる。] 図１１ 図１５ 図３１Ａ 図３１Ｂ
[0054] ＢＭＰ−６の中央領域は、ＢＭＰ−７の中央領域と７つのアミノ酸が異なる。したがって、ＢＭＰ−７の中央のセグメントをＢＭＰ−６の対応する残基で置換することは、ＢＭＰ−７で７つのアミノ酸置換、すなわち、Ｒ４８Ｑ、Ｅ６０Ｋ、Ｙ６５Ｎ、Ｅ６８Ｄ、Ａ７２Ｓ、Ｓ７７ＡおよびＹ７８Ｈ（配列番号９）を加えることに等しい。したがって、本発明の一実施形態は、位置Ｒ４８、Ｅ６０、Ｙ６５、Ｅ６８、Ａ７２、Ｓ７７およびＹ７８の各々でアミノ酸置換を有する改変ＢＭＰ−７タンパク質である。好ましい実施形態では、改変ＢＭＰ−７タンパク質は、以下のアミノ酸置換、すなわち、Ｒ４８Ｑ、Ｅ６０Ｋ、Ｙ６５Ｎ、Ｅ６８Ｄ、Ａ７２Ｓ、Ｓ７７ＡおよびＹ７８Ｈ（配列番号９）のすべてを含む。]
[0055] さらに、本発明は、位置４８、６０、６５、６８、７２、７７および７８に対応するＢＭＰの位置を変化させることによって、Ｎｏｇｇｉｎ阻害への耐性を有するＢＭＰ突然変異体を作製することを企図する。前に述べたように、突然変異体の置換はＢＭＰ−６の対応する位置と同じアミノ酸を有する突然変異体をもたらすことができるが、本発明によって、改変ＢＭＰで、ＢＭＰ−６の位置に対応する位置で、ＢＭＰ−６の対応する位置のアミノ酸と同一でなく、むしろ類似した生化学的性状を有する、すなわち、ＢＭＰ−６のアミノ酸を保存するアミノ酸を置換することも可能である。例えば、ＢＭＰ−６のアミノ酸が疎水性である場合、本発明の一実施形態によれば、突然変異体の対応する位置に、異なるがなお疎水性のアミノ酸を置換すること、または、例えばＢＭＰ−６残基が親水性の場合、異なるがなお親水性のアミノ酸を置換することが可能である。]
[0056] 本発明の別の実施形態では、改変ＢＭＰ−７タンパク質は、位置Ｒ４８、Ｅ６０、Ｙ６５、Ｅ６８、Ａ７２、Ｓ７７およびＹ７８のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つにおける置換を有する。]
[0057] 例えば、本発明は、以下の位置、Ｒ４８、Ｅ６０、Ｙ６５、Ｅ６８、Ａ７２、Ｓ７７およびＹ７８のうちの少なくとも１つにおいて置換を有する、改変ＢＭＰ−７を企図する。一実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、位置Ｒ４８でのアミノ酸置換を有する。例えば、改変は、位置４８のＲ残基の代わりの、Ｑ、Ｎ、Ｗ、ＹまたはＦ残基の置換であってよい。別の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、位置Ｅ６０でのアミノ酸置換を有する。例えば、改変は、位置６０のＥ残基の代わりの、Ｋ、Ｒ、Ｈ、ＮまたはＱ残基の置換であってよい。別の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、位置Ｙ６５でのアミノ酸置換を有する。例えば、改変は、位置６５のＹ残基の代わりの、Ｎ、Ｑ、Ｈ、ＫまたはＲ残基の置換であってよい。別の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、位置Ｅ６８でのアミノ酸置換を有する。別の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、位置Ａ７２でのアミノ酸置換を有する。例えば、改変は、位置７２のＡ残基の代わりの、Ｓ、Ｔ、Ｙ、ＮまたはＱ残基の置換であってよい。別の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、位置Ｓ７７でのアミノ酸置換を有する。別の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、位置Ｓ７８でのアミノ酸置換を有する。]
[0058] 別の実施形態では、本発明は、以下のアミノ酸置換、すなわち、Ｒ４８Ｑ、Ｅ６０Ｋ、Ｙ６５Ｎ、Ｅ６８Ｄ、Ａ７２Ｓ、Ｓ７７ＡおよびＹ７８Ｈの少なくとも１つ、または、ＢＭＰ−６の対応するアミノ酸を保存するアミノ酸によるこれらの位置の１つまたは複数での置換を有する、改変ＢＭＰ−７を企図する。]
[0059] 一実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、アミノ酸置換Ｒ４８Ｑを有する。一実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、アミノ酸置換Ｅ６０Ｋを有する。別の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、アミノ酸置換Ｙ６５Ｎを有する。別の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、アミノ酸置換Ｅ６８Ｄを有する。別の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、アミノ酸置換Ａ７２Ｓを有する。別の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、アミノ酸置換Ｓ７７Ａを有する。別の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、アミノ酸置換Ｙ７８Ｈを有する。本発明の別の実施形態に従い、改変ＢＭＰ−７は、位置Ｒ４８、Ｉ５７、Ｉ１１２、Ｆ１１７、Ｖ１２３、Ｉ１２４、Ｌ１２５、Ｋ１２６、Ｋ１２７、Ｋ１２９、Ｎ１３０もしくはＲ１３４の１つまたは複数の置換、または、ＢＭＰ−６の対応するアミノ酸を保存するアミノ酸によるこれらの位置の１つまたは複数における置換を含むことができる。]
[0060] さらに、改変ＢＭＰ−７は、上記の位置のうちの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または全１２個における置換を含むことができる。]
[0061] 例えば、本発明の一実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、以下の置換、Ｒ４８Ａ、Ｒ４８ＤまたはＲ４８Ｎのうちの１つを含むことができる。]
[0062] 本発明の別の実施形態によると、改変ＢＭＰ−７は、位置５４の置換を含むことができる。例えば、改変は、Ｄ５４ＥまたはＤ５４Ｒの１つであってよい。]
[0063] 本発明の別の実施形態によると、改変ＢＭＰ−７は、位置５７の置換を含むことができる。例えば、改変は、Ｉ５７Ａ、Ｉ５７Ｄ、Ｉ５７ＰまたはＩ５７Ｒの１つであってよい。]
[0064] 本発明の別の実施形態によると、改変ＢＭＰ−７は、位置１１２の置換を含むことができる。例えば、改変は、Ｉ１１２Ａ、Ｉ１１２Ｈ、Ｉ１１２ＤまたはＩ１１２Ｐの１つであってよい。]
[0065] 本発明の別の実施形態によると、改変ＢＭＰ−７は、位置１１７の置換を含むことができる。例えば、改変は、Ｆ１１７Ａ、Ｆ１１７Ｄ、Ｆ１１７Ｋ、Ｆ１１７ＴまたはＦ１１７Ｗの１つであってよい。]
[0066] 本発明の別の実施形態によると、改変ＢＭＰ−７は、位置１２３の置換を含むことができる。例えば、改変は、Ｖ１２３またはＶ１２３Ｄの１つであってよい。]
[0067] 本発明の別の実施形態によると、改変ＢＭＰ−７は、位置１２４の置換を含むことができる。例えば、改変は、Ｉ１２４ＡまたはＩ１２４Ｄの１つであってよい。]
[0068] 本発明の別の実施形態によると、改変ＢＭＰ−７は、位置１２５の置換を含むことができる。例えば、改変は、Ｌ１２５Ａ、Ｌ１２５ＤまたはＬ１２５Ｒの１つであってよい。]
[0069] 本発明の別の実施形態によると、改変ＢＭＰ−７は、位置１２６の置換を含むことができる。例えば、改変は、Ｋ１２６Ａ、Ｋ１２６Ｄ、Ｋ１２６Ｈ、Ｋ１２６Ｅ、Ｋ１２６ＹまたはＫ１２６Ｗの１つであってよい。]
[0070] 本発明の別の実施形態によると、改変ＢＭＰ−７は、位置１２７の置換を含むことができる。例えば、改変は、Ｋ１２７Ａ、Ｋ１２７Ｄ、Ｋ１２７Ｈ、Ｋ１２７Ｗ、Ｋ１２７ＥおよびＫ１２７Ｒの１つであってよい。]
[0071] 本発明の別の実施形態によると、改変ＢＭＰ−７は、位置１２９の置換を含むことができる。例えば、改変は、Ｋ１２９Ｅであってよい。]
[0072] 本発明の別の実施形態によると、改変ＢＭＰ−７は、位置１３０の置換を含むことができる。例えば、改変は、Ｎ１３０Ｄであってよい。]
[0073] 本発明の別の実施形態によると、改変ＢＭＰ−７は、位置１２４の置換を含むことができる。例えば、改変は、Ｒ１３４Ｅであってよい。]
[0074] 本発明は、位置Ｒ４８、Ｅ６０、Ｙ６５、Ｅ６８、Ａ７２、Ｓ７７およびＹ７８のうちの少なくとも２つにおいて置換されている、改変ＢＭＰ−７を企図する。例えば、一実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、位置Ｒ４８およびＥ６０で置換を有する。別の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、位置Ｒ４８およびＳ７７で置換を有する。別の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、位置Ｅ６０およびＹ６５で置換を有する。別の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、位置Ｙ６５およびＹ７８で置換を有する。別の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、位置Ｓ７７およびＹ７８で置換を有する。別の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、位置Ｙ６５およびＡ７２で置換を有する。別の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、位置Ｅ６０およびＡ７２で置換を有する。別の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、位置Ｒ４８およびＡ７２で置換を有する。]
[0075] 別の実施形態では、本発明は、以下のアミノ酸置換、すなわち、Ｒ４８Ｑ、Ｅ６０Ｋ、Ｙ６５Ｎ、Ｅ６８Ｄ、Ａ７２Ｓ、Ｓ７７ＡおよびＹ７８Ｈの少なくとも２つ、または、ＢＭＰ−６の対応するアミノ酸を保存するアミノ酸によるこれらの位置の１つまたは複数での置換を有する、改変ＢＭＰ−７を企図する。例えば、一実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、改変Ｒ４８ＱおよびＳ７７Ａを有する。別の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、改変Ｒ４８ＱおよびＥ６０Ｋを有する。別の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、改変Ｅ６０ＫおよびＹ６５Ｎを有する。別の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、改変Ｙ６５ＮおよびＹ７８Ｈを有する。別の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、改変Ｓ７７ＡおよびＹ７８Ｈを有する。別の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、改変Ｒ４８ＡおよびＡ７２Ｓを有する。別の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、改変Ｅ６０ＫおよびＡ７２Ｓを有する。さらに別の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、改変Ｙ６５ＮおよびＡ７２Ｓを有する。]
[0076] 本発明のさらなる実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、以下の位置、Ｒ４８、Ｉ５７、Ｅ６０、Ｙ６５、Ｅ６８、Ａ７２、Ｓ７７、Ｙ７８、Ｉ１１２、Ｆ１１７、Ｖ１２３、Ｉ１２４、Ｌ１２５、Ｋ１２６、Ｋ１２７、Ｋ１２９、Ｎ１３０およびＲ１３４の２つ以上で置換を有する。例えば、一実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、位置Ｒ４８およびＦ１１７のそれぞれで置換を有する。特定の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、改変Ｒ４８ＡおよびＦ１１７Ｗを有する。例えば、一実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、位置Ｒ４８およびＦ１１２のそれぞれで置換を有する。特定の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、改変Ｒ４８ＡおよびＦ１１２Ａを有する。例えば、一実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、位置Ｙ６５およびＲ１３４のそれぞれで置換を有する。特定の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、改変Ｙ６５ＮおよびＲ１３４Ｅを有する。例えば、一実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、位置Ｙ７８およびＲ１３４のそれぞれで置換を有する。特定の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、改変Ｙ７８ＨおよびＲ１３４Ｅを有する。例えば、一実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、位置Ｋ１２６およびＫ１２７のそれぞれで置換を有する。特定の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、改変Ｋ１２６ＥおよびＫ１２７Ｅを有する。例えば、一実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、位置Ｒ１２９およびＮ１３０のそれぞれで置換を有する。特定の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、改変Ｒ１２９ＥおよびＮ１３０Ｄを有する。]
[0077] 本発明は、位置Ｒ４８、Ｅ６０、Ｙ６５、Ｅ６８、Ａ７２、Ｓ７７およびＹ７８のうちの３つ以上でアミノ酸置換されている、改変ＢＭＰ−７も企図する。例えば、一実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、位置Ｅ６０、Ｙ６５およびＡ７２のそれぞれで置換を有する。別の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、位置Ｒ４８、Ｅ６０およびＹ６５のそれぞれで置換を有する。]
[0078] 本発明は、以下のアミノ酸置換、すなわち、Ｒ４８Ｑ、Ｅ６０Ｋ、Ｙ６５Ｎ、Ｅ６８Ｄ、Ａ７２Ｓ、Ｓ７７ＡおよびＹ７８Ｈの少なくとも３つ、または、ＢＭＰ−６の対応するアミノ酸を保存するアミノ酸によるこれらの位置の１つまたは複数での置換を有する、改変ＢＭＰ−７を企図する。特定の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、置換Ｅ６０Ｋ、Ｙ６５ＮおよびＡ７２Ｓを含む。別の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、置換Ｒ４８Ｑ、Ｅ６０ＫおよびＹ６５Ｎを含む。さらに別の実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、置換Ｒ４８Ｑ、Ｅ６０ＫおよびＳ７７Ａを含む。]
[0079] 本発明は、位置Ｒ４８、Ｅ６０、Ｙ６５、Ｅ６８、Ａ７２、Ｓ７７およびＹ７８のうちの４つ以上でアミノ酸置換されている、改変ＢＭＰ−７も企図する。例えば、一実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、位置Ｒ４８、Ｅ６０、Ｙ６５およびＡ７２のそれぞれで置換を有する。例えば、位置Ｒ４８で、Ｑ、Ｎ、Ｗ、ＹまたはＦ残基が、Ｒ残基の代わりに置換される。例えば、位置Ｅ６０で、Ｋ、Ｒ、Ｎ、ＨまたはＱ残基が、Ｅ残基の代わりに置換される。例えば、位置Ｙ６５で、Ｎ、Ｑ、Ｈ、ＫまたはＲ残基が、Ｙ残基の代わりに置換される。例えば、位置Ａ７２で、Ｓ、Ｔ、Ｙ、ＮまたはＱ残基が、Ａ残基の代わりに置換される。]
[0080] 本発明は、以下のアミノ酸置換、すなわち、Ｒ４８Ｑ、Ｅ６０Ｋ、Ｙ６５Ｎ、Ｅ６８Ｄ、Ａ７２Ｓ、Ｓ７７ＡおよびＹ７８Ｈの少なくとも４つ、または、ＢＭＰ−６の対応するアミノ酸を保存するアミノ酸によるこれらの位置の１つまたは複数での置換を有する、改変ＢＭＰ−７を企図する。例えば、一実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、置換Ｒ４８Ｑ、Ｅ６０Ｋ、Ｙ６５ＮおよびＡ７２Ｓを含む。]
[0081] 本発明は、以下の位置、Ｒ４８、Ｅ６０、Ｙ６５、Ｅ６８、Ａ７２、Ｓ７７およびＹ７８のうちの５、６または７つすべてでアミノ酸置換されている、改変ＢＭＰ−７をさらに企図する。一実施形態では、置換は、７つの位置の各々で生成される。さらなる実施形態では、改変ＢＭＰ−７は、以下のアミノ酸置換、すなわち、Ｒ４８Ｑ、Ｅ６０Ｋ、Ｙ６５Ｎ、Ｅ６８Ｄ、Ａ７２Ｓ、Ｓ７７ＡおよびＹ７８Ｈの５、６または全７個、または、ＢＭＰ−６の対応するアミノ酸を保存するアミノ酸によるこれらの位置の１つまたは複数での置換を含む。]
[0082] ＢＭＰサブファミリーメンバーは、配列および機能の両方で保存されるので、所与のＢＭＰサブファミリーメンバーの中央領域をＢＭＰ−６の対応する領域で置換することは、Ｎｏｇｇｉｎへの耐性を与えることが予想される。本発明は、ＢＭＰ−６のＶａｌ４５〜Ａｓｎ８０の領域のアミノ酸配列の１つまたは複数が、任意のＢＭＰサブファミリーメンバーの対応する領域の１つまたは複数のアミノ酸配列を置換する、ＮｏｇｇｉｎまたはＮｏｇｇｉｎ様タンパク質による阻害に耐性である改変タンパク質を設計することを企図する。]
[0083] 例えば、本発明は、以下の位置、すなわちＤ２２、Ｓ２４、Ｖ２６、Ｎ２９、Ｖ３３、Ｐ３６、Ｈ３９、Ｆ４１、Ｈ４４、Ｐ４８、Ａ５２、Ｄ５３および／またはＬ５５の少なくとも１つにおいてアミノ酸置換を含む、改変ＢＭＰ−２を企図する。一実施形態では、改変ＢＭＰ−２は、上記の位置の各々で改変を含む。好ましい実施形態では、改変ＢＭＰ−２は、Ｓ２４、Ｐ３６、Ｆ４１、Ｈ４４、Ｐ４８およびＤ５３の各々で置換を含む。好ましい実施形態では、改変ＢＭＰ−２は、以下の位置、Ｓ２４、Ｐ３６、Ｆ４１、Ｈ４４、Ｐ４８およびＤ５３の１つまたは複数で置換を含む。別の好ましい実施形態では、改変ＢＭＰ−２は、Ｐ３６で置換を含む。]
[0084] 本発明は、以下のアミノ酸置換、すなわち、Ｄ２２Ｓ、Ｓ２４Ｑ、Ｖ２６Ｌ、Ｎ２９Ｑ、Ｖ３３Ｉ、Ｐ３６Ｋ、Ｈ３９Ａ、Ｆ４１Ｎ、Ｈ４４Ｄ、Ｐ４８Ｓ、Ａ５２Ｎ、Ｄ５３Ａおよび／またはＬ５５Ｍの少なくとも１つ、または、ＢＭＰ−６の対応するアミノ酸を保存するアミノ酸によるこれらの位置の１つまたは複数での置換を含む、改変ＢＭＰ−２も企図する。一実施形態では、改変ＢＭＰ−２は、上記のアミノ酸置換のすべてを含む。好ましい実施形態では、改変ＢＭＰ−２は、以下のアミノ酸置換、Ｓ２４Ｑ、Ｐ３６Ｋ、Ｆ４１Ｎ、Ｈ４４Ｄ、Ｐ４８Ｓおよび／またはＤ５３Ａの各々を含む。好ましい実施形態では、改変ＢＭＰ−２は、以下のアミノ酸置換、Ｓ２４Ｑ、Ｐ３６Ｋ、Ｆ４１Ｎ、Ｈ４４Ｄ、Ｐ４８Ｓおよび／またはＤ５３Ａの１つまたは複数を含む。別の好ましい実施形態では、改変ＢＭＰ−２は、アミノ酸置換Ｐ３６Ｋを含む。]
[0085] 別の実施形態では、本発明は、以下の位置、すなわち、Ｄ２４、Ｓ２６、Ｖ２８、Ｎ３１、Ｖ３５、Ｐ３８、Ｑ４１、Ｆ４３、Ｈ４６、Ｄ４８、Ｐ５０、Ａ５４、Ｄ５５およびＬ５７の少なくとも１つにおいてアミノ酸置換を含む、改変ＢＭＰ−４に関する。一実施形態では、改変ＢＭＰ−４は、上記の位置の各々で改変を含む。好ましい実施形態では、改変ＢＭＰ−４は、以下の位置Ｓ２６、Ｐ３８、Ｆ４３、Ｐ５０およびＡ５４の１つまたは複数でアミノ酸置換を含む。好ましい実施形態では、改変ＢＭＰ−４は、以下の位置、Ｓ２６、Ｐ３８、Ｆ４３、Ｐ５０およびＡ５４の各々でアミノ酸置換を含む。別の好ましい実施形態では、改変ＢＭＰ−４は、Ｐ３８で置換を含む。]
[0086] 別の実施形態では、本発明は、以下のアミノ酸置換、すなわち、Ｄ２４Ｓ、Ｓ２６Ｑ、Ｖ２８Ｌ、Ｎ３１Ｑ、Ｖ３５Ｉ、Ｐ３８Ｋ、Ｑ４１Ａ、Ｆ４３Ｎ、Ｈ４６Ｄ、Ｄ４８Ｅ、Ｐ５０Ｓ、Ａ５４Ｎ、Ｄ５５ＡおよびＬ５７Ｍの少なくとも１つ、または、ＢＭＰ−６の対応するアミノ酸を保存するアミノ酸によるこれらの位置の１つまたは複数での置換を含む、改変ＢＭＰ−４に関する。別の実施形態では、改変ＢＭＰ−４は、上記のアミノ酸置換のすべてを含む。好ましい実施形態では、改変ＢＭＰ−４は、アミノ酸置換Ｓ２６Ｑ、Ｐ３８Ｋ、Ｆ４３Ｎ、Ｐ５０Ｓおよび／またはＡ５４Ｎの１つまたは複数を含む。別の好ましい実施形態では、改変ＢＭＰ−４は、アミノ酸置換Ｓ２６Ｑ、Ｐ３８Ｋ、Ｆ４３Ｎ、Ｐ５０Ｓおよび／またはＡ５４Ｎの各々を含む。さらに別の好ましい実施形態では、改変ＢＭＰ−４は、置換Ｐ３８Ｋを含む。]
[0087] 別の実施形態では、本発明は、以下の位置、すなわちＲ４１、Ｅ５３またはＦ５８の少なくとも１つにおいてアミノ酸置換を含む、改変ＢＭＰ−５に関する。好ましい実施形態では、改変ＢＭＰ−５は、位置Ｒ４１、Ｅ５３およびＦ５８の各々で置換を含む。さらに別の好ましい実施形態では、改変ＢＭＰ−５は、位置Ｅ５３で置換を含む。]
[0088] 別の実施形態では、本発明は、アミノ酸置換、Ｒ４１Ｑ、Ｅ５３ＫまたはＦ５８Ｎの少なくとも１つ、または、ＢＭＰ−６の対応するアミノ酸を保存するアミノ酸によるこれらの位置の１つまたは複数での置換を含む、改変ＢＭＰ−５に関する。好ましい実施形態では、改変ＢＭＰ−５は、以下のアミノ酸置換、Ｒ４１Ｑ、Ｅ５３ＫまたはＦ５８Ｎの各々で置換を含む。さらに別の好ましい実施形態では、改変ＢＭＰ−５は、アミノ酸置換Ｅ５３Ｋを含む。]
[0089] 本発明は、改変成長分化因子（ＧＤＦ）にも関する。ＧＤＦも、ＢＭＰサブファミリーのメンバーである。]
[0090] 例えば、本発明は、以下の位置、すなわちＮ２７、Ｋ２９、Ｍ３１、Ｄ３４、Ｌ４１、Ｅ４２、Ｅ４４、Ｆ４６、Ｈ４７、Ｅ４９、Ｌ５１、Ｅ５３、Ｒ５７、Ｓ５８、Ｌ６０およびＥ６１の少なくとも１つにおいてアミノ酸置換を含む、改変ＧＤＦ−５を企図する。好ましい実施形態では、改変ＧＤＦ−５は、位置Ｌ４１でアミノ酸置換を含む。さらに、本発明は、以下のアミノ酸置換、Ｎ２７Ｓ、Ｋ２９Ｑ、Ｍ３１Ｌ、Ｄ３４Ｑ、Ｌ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｅ４４Ａ、Ｆ４６Ｎ、Ｈ４７Ｙ、Ｅ４９Ｄ、Ｌ５１Ｅ、Ｅ５３Ｓ、Ｒ５７Ｎ、Ｓ５８Ａ、Ｌ６０ＭおよびＥ６１Ｎのうちの少なくとも１つ、または、ＢＭＰ−６の対応するアミノ酸を保存するアミノ酸によるこれらの位置の１つまたは複数における置換を含む、改変ＧＤＦ−５を企図する。好ましい実施形態では、改変ＧＤＦ−５は、アミノ酸置換Ｌ４１Ｋを含む。]
[0091] 別の実施形態では、本発明は、位置Ｎ２７、Ｋ２９、Ｅ３０、Ｄ３４、Ｌ４１、Ｅ４２、Ｅ４４、Ｙ４６、Ｈ４７、Ｅ４８、Ｖ５１、Ｄ５３、Ｒ５７、Ｓ５８、Ｌ６０およびＥ６１の少なくとも１つにおいてアミノ酸置換を含む、改変ＧＤＦ−６に関する。好ましい実施形態では、改変ＧＤＦ−６は、位置Ｌ４１でアミノ酸置換を含む。別の実施形態では、本発明は、アミノ酸置換、Ｎ２７Ｓ、Ｋ２９Ｑ、Ｅ３０Ｄ、Ｄ３４Ｑ、Ｌ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｅ４４Ａ、Ｙ４６Ｎ、Ｈ４７Ｙ、Ｅ４８Ｄ、Ｖ５１Ｅ、Ｄ５３Ｓ、Ｒ５７Ｎ、Ｓ５８Ａ、Ｌ６０ＭおよびＥ６１Ｎの１つまたは複数、または、ＢＭＰ−６の対応するアミノ酸を保存するアミノ酸によるこれらの位置の１つまたは複数における置換を含む、改変ＧＤＦ−６に関する。好ましい実施形態では、改変ＧＤＦ−６は、アミノ酸置換Ｌ４１Ｋを含む。]
[0092] さらに別の実施形態では、本発明は、以下の位置、すなわちＤ３６、Ｋ３８、Ｅ３９Ｄ、Ｄ４３、Ｌ５０、Ｄ５１、Ｅ５３、Ｙ５５、Ｈ５６、Ｅ５８、Ｌ６０、Ｄ６２、Ｒ６６、Ｓ６７、Ｌ６９およびＥ７０の少なくとも１つにおいてアミノ酸置換を含む、改変ＧＤＦ−７を企図する。好ましい実施形態では、改変ＧＤＦ−７は、位置Ｌ５０でアミノ酸置換を含む。さらに別の実施形態では、本発明は、Ｄ３６Ｓ、Ｋ３８Ｑ、Ｅ３９Ｄ、Ｄ４３Ｑ、Ｌ５０Ｋ、Ｄ５１Ｇ、Ｅ５３Ａ、Ｙ５５Ｎ、Ｈ５６Ｙ、Ｅ５８Ｄ、Ｌ６０Ｅ、Ｄ６２Ｓ、Ｒ６６Ｎ、Ｓ６７Ａ、Ｌ６９ＭおよびＥ７０Ｎからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、または、ＢＭＰ−６の対応するアミノ酸を保存するアミノ酸によるこれらの位置の１つまたは複数における置換を含む、改変ＧＤＦ−７を企図する。好ましい実施形態では、改変ＧＤＦ−７は、アミノ酸置換Ｌ５０Ｋを含む。]
[0093] 本発明の前述の実施形態は、本発明の範囲を限定するものではない。具体的に記載されたものの他のＢＭＰサブファミリーメンバーを、同様に改変することができる。追加のアミノ酸の置換、欠失または付加を加えてもよい。要求されるすべては、ＢＭＰサブファミリーメンバーの中央部のアミノ酸残基の１つまたは複数が、ＢＭＰ−６からの対応する１つまたは複数のアミノ酸残基で置換され、その結果、生じるタンパク質が野生型ＢＭＰサブファミリーメンバーにも、野生型ＢＭＰ−６にも同一でなく、天然存在のタンパク質でないことである。]
[0094] さらに、前に指摘したように、ＢＭＰ−９もＢＭＰ−６のそれに類似した程度のＮｏｇｇｉｎ阻害耐性を有する（図３１Ｂを参照）ので、ＢＭＰ−９の中央領域、すなわち、図３５に示すＢＭＰ−９の残基Ｖａｌ７６〜Ｔｈｒ１１１である、ＢＭＰ−６の残基４５〜８０に対応するＢＭＰ−９の領域に対応するＢＭＰ突然変異体が作製されることも、本発明によって企図される。] 図３１Ｂ 図３５
[0095] 例えば、本発明の改変ＢＭＰ−７は、ＢＭＰ−７の位置Ｓ４６、Ｒ４８、Ｌ５０、Ｑ５３、Ｄ５４、Ｅ６０、Ｇ６１、Ａ６３、Ｙ６６、Ｅ６８、Ｅ７０、Ａ７２、Ｎ７６、Ｓ７７、Ｙ７８、Ｍ７９および／またはＮ８０の任意の１つまたは複数で改変を含むことができる。詳細には、改変ＢＭＰ−７は、以下の改変、Ｓ４６Ｎ、Ｒ４８Ｅ、Ｌ５０Ｉ、Ｑ５３Ｄ、Ｄ５４Ｓ、Ｅ６０Ｋ、Ｇ６１Ｅ、Ａ６３Ｅ、Ｙ６６Ｅ、Ｅ６８Ｋ、Ｅ７０Ｇ、Ａ７２Ｆ、Ｎ７６Ａ、Ｓ７７Ｄ、Ｙ７８Ｄ、Ｍ７９Ｖおよび／またはＮ８０Ｔの任意の１つまたは複数、または、ＢＭＰ−９の対応するアミノ酸を保存するこれらの位置のいずれか１つにおけるアミノ酸の置換を含むことができる。]
[0096] 例えば、本発明の改変ＢＭＰ−２は、ＢＭＰ−２の位置Ｄ２２、Ｓ２４、Ｖ２６、Ｎ２９、Ｄ３０、Ｖ３３、Ｐ３６、Ｇ３７、Ｈ３８、Ｆ４０、Ｙ４１、Ｈ４３、Ｅ４５、Ｐ４７、Ｈ５４、Ｌ５５および／またはＮ５６の任意の１つまたは複数で改変を含むことができる。詳細には、改変ＢＭＰ−２は、以下の改変、Ｄ２２Ｎ、Ｓ２４Ｅ、Ｖ２６Ｉ、Ｎ２９９Ｄ、Ｄ３０Ｓ、Ｖ３３Ｉ、Ｐ３６Ｋ、Ｇ３７Ｅ、Ｈ３８Ｅ、Ｆ４０Ｙ、Ｙ４１Ｅ、Ｈ４３Ｋ、Ｅ４５Ｇ、Ｐ４７Ｆ、Ｈ５４Ｄ、Ｌ５５Ｖおよび／またはＮ５６Ｔの任意の１つまたは複数、または、ＢＭＰ−９の対応するアミノ酸を保存するこれらの位置のいずれか１つにおけるアミノ酸置換を含むことができる。]
[0097] 例えば、本発明の改変ＢＭＰ−４は、ＢＭＰ−４の位置Ｄ２４、Ｓ２６、Ｖ２８、Ｎ３１、Ｄ３２、Ｖ３５、Ｐ３８、Ｇ３９、Ｑ４１、Ｆ４３、Ｙ４４、Ｈ４６、Ｄ４８、Ｐ５０、Ｈ５６、Ｌ５７および／またはＮ５６８の任意の１つまたは複数で改変を含むことができる。詳細には、改変ＢＭＰ−４は、以下の改変、Ｄ２４Ｎ、Ｓ２６Ｅ、Ｖ２８Ｉ、Ｎ３１Ｄ、Ｄ３２Ｓ、Ｖ３５Ｉ、Ｐ３８Ｋ、Ｇ３９Ｅ、Ｑ４１Ｅ、Ｆ４３Ｙ、Ｙ４４３、Ｈ４６Ｋ、Ｄ４８Ｇ、Ｐ５０Ｆ、Ｈ５６Ｄ、Ｌ５７Ｖおよび／またはＮ５８Ｔの任意の１つまたは複数、またはＢＭＰ−９の対応するアミノ酸を保存するアミノ酸の置換を含むことができる。]
[0098] 例えば、本発明の改変ＢＭＰ−５は、ＢＭＰ−５の位置Ｓ３９、Ｒ４１、Ｌ４３、Ｑ４６、Ｄ４７、Ｅ５３、Ｇ５４、Ａ５６、Ｆ５８、Ｙ５９、Ｄ６１、Ｅ６３、Ｓ６５、Ｎ６９、Ａ７０、Ｈ７１、Ｍ７２および／またはＮ７３の任意の１つまたは複数で改変を含むことができる。詳細には、改変ＢＭＰ−５は、以下の改変、Ｓ３９Ｎ、Ｒ４１Ｅ、Ｌ４３Ｉ、Ｑ４６Ｄ、Ｄ４７Ｓ、Ｅ５３Ｋ、Ｇ５４Ｅ、Ａ５６Ｅ、Ｆ５８Ｙ、Ｙ５９Ｅ、Ｄ６１Ｋ、Ｅ６３Ｇ、Ｓ６５Ｆ、Ｎ６９Ａ、Ａ７０Ｄ、Ｈ７１Ｄ、Ｍ７２Ｖおよび／またはＮ７３Ｔの任意の１つまたは複数、または、ＢＭＰ−９の対応するアミノ酸を保存するアミノ酸によるこれらの位置の１つまたは複数における置換を含むことができる。]
[0099] ＢＭＰ−９の対応するアミノ酸残基に対応するそれらの中央領域で改変を有する、または、ＢＭＰ−９の中央領域の対応するアミノ酸を保存する、それらの中央領域での置換を有する、本発明による改変ＧＤＦ−５、−６および−７を作製することもできる。
改変ＢＭＰの生成
本明細書で用いるように、「設計されたＢＭＰ」、「改変ＢＭＰ」、「キメラＢＭＰ」、「突然変異体ＢＭＰ」および「変異体ＢＭＰ」は、特に明記しない限り同等物として用いられる。本明細書で、「設計されたＢＭＰ」または「改変ＢＭＰ」、およびそれらの文法同等物は、野生型または親のＢＭＰと、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失または置換が異なる、天然に存在しないＢＭＰを意味する。特に明記しない限り、設計または改変ＢＭＰのすべての位置番号付けは、成熟した天然ＢＭＰの配列に基づく点に留意する必要がある。設計されたＢＭＰは、変異の所定の性質によって特徴づけられ、それは、ＢＭＰ配列の天然の対立遺伝子または種間変異からそれらを区別する特徴である。ＢＭＰ変異体は、１つまたは複数の細胞型で、野生型ＢＭＰ活性の少なくとも５０％を保持しなければならず、それは、下で記載される適当なアッセイを用いて測定される。野生型活性の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％を保持する変異体がより好ましく、野生型よりも活性である変異体が特に好ましい。設計または改変ＢＭＰは、Ｎ末端、Ｃ末端または内部に、挿入、欠失および／または置換を含むことができる。好ましい実施形態では、設計または改変ＢＭＰは、最も類似するヒトＢＭＰ配列と異なる少なくとも１つの残基を有し、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の異なる残基がより好ましい。]
[0100] さらに、本発明の一実施形態によれば、設計または改変ＢＭＰは、野生型ＢＭＰ−６または野生型ＢＭＰ−９と同一ではない。]
[0101] 本発明の設計または改変ＢＭＰは、対応する野生型ＢＭＰタンパク質配列と、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を維持する。]
[0102] 本発明の設計または改変ＢＭＰは、対応する野生型ＢＭＰタンパク質配列のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を維持することができる。]
[0103] 「対応する野生型タンパク質」は、改変ＢＭＰの野生型版を意味する。例えば、改変ＢＭＰが改変ＢＭＰ−７である場合、対応する野生型ＢＭＰは野生型ＢＭＰ−７である。]
[0104] ２つのアミノ酸配列、または２つの核酸の同一性割合を測定するために、配列を最適比較のためにアラインメントさせる（例えば、第二のアミノ酸または核酸配列との最適アラインメントのために、ギャップを第一のアミノ酸配列または核酸配列に導入することができる）。２つの配列間の同一性割合は、配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、相同性割合＝同一位置の数／位置総数×１００）。２つの配列間の相同性割合の判定は、数値計算用アルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列の比較のために利用される数値計算用アルゴリズムの好ましい、非限定的例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０巻：５８７３〜７７頁のように修正された、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７巻：２２６４〜６８頁のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５巻：４０３〜１０頁のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施することができる。比較目的のためにギャップトアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ ２５巻（１７号）：３３８９〜３４０２頁に記載のＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを用いることができる。]
[0105] 設計または改変ＢＭＰは、さらなる改変、例えば安定性もしくは免疫原性などのさらなるタンパク質特性を変化させる突然変異、または、ペグ化またはグリコシル化などの翻訳後改変を可能にするか阻止する突然変異を含むことができる。改変ＢＭＰには、それらに限定されないが、１つまたは複数の側鎖または末端の合成誘導体化、グリコシル化、ペグ化、環状置換、環化、タンパク質またはタンパク質ドメインへの融合、およびペプチドタグまたは標識の付加を含む、翻訳と同時またはその後の改変を加えることができる。本明細書で、「設計されたＢＭＰ核酸」、「改変ＢＭＰ核酸」、「キメラＢＭＰ核酸」、「変異体ＢＭＰ核酸」、「突然変異体ＢＭＰ核酸」および文法同等物は、設計または改変ＢＭＰをコードする核酸を意味する。遺伝子コードの同義性のために、極めて多数の核酸を作製することができ、それらのすべては、設計されたＢＭＰのアミノ酸配列を変化させない方法で１つまたは複数のコドン配列を単に改変することによって、本発明の設計または改変ＢＭＰをコードする。本出願では、「または」の使用は、特に明記しない限り「および／または」を意味する。]
[0106] 上記のように、ＢＭＰは、本来、長いプロドメイン、１つまたは複数の切断部位、および成熟したドメインを含むプロタンパク質として発現される。その後、このプロタンパク質は細胞機構によって加工され、二量体成熟ＢＭＰ分子を産する。好ましい実施形態では、本発明の改変ＢＭＰは、同様の方法で生成される。プロドメインは、ＢＭＰの正しい折畳みおよびプロセシングを助けると考えられている。さらに、すべてではないが一部のＢＭＰで、プロドメインは成熟ドメインに非共有結合的に結合することができ、シャペロンならびに阻害剤として作用することができる（例えば、Ｔｈｉｅｓら（２００１年）Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、１８巻：２５１〜２５９頁）。好ましくは、本発明の改変ＢＭＰは、この形で生成および／または治療的投与される。あるいは、ＢＭＰは、それらに限定されないが、直接に生成されるか封入体から再折畳みされる成熟ドメイン、または完全長無傷のプロタンパク質を含む他の形で生成することができる。本発明の改変ＢＭＰは、これらおよび他の形で使用されることが予想される。]
[0107] 好ましい実施形態では、本発明の改変骨形成タンパク質は、改変または突然変異体のヒトＢＭＰ−７などの、改変ＢＭＰ−７である。ヒトＢＭＰ−７の天然のプロタンパク質のアミノ酸配列を、図１Ａに示す。天然の成熟ヒトＢＭＰ−７のアミノ酸配列を、図１Ｂに示す。ヒトＢＭＰ−７の成熟した二量体形のサブユニットのアミノ酸配列を図１Ｂに示すが、各サブユニットは、独立に完全長であるか、またはＮ末端で切り詰められてもよいことを理解すべきである。例えば、サブユニットは、図１Ｂに示す完全長成熟形の残基１〜３７のいずれか、またはすべてを有することができる。本発明の改変ＢＭＰ核酸およびタンパク質は、下で詳述する当技術分野で公知であるいくつかの方法を用いて生成することができる。
改変ＢＭＰをコードする核酸の調製
本発明は、本明細書に記載される改変ＢＭＰをコードする核酸も含む。本明細書に記載される改変ＢＭＰをコードする核酸は、当技術分野で公知である方法によって調製することができる。] 図１Ａ 図１Ｂ
[0108] 好ましい実施形態では、改変ＢＭＰをコードする核酸は、全遺伝子合成によって、または、野生型または改変型ＢＭＰをコードする核酸の部位特異的突然変異によって調製される。鋳型指定連結、再帰的ＰＣＲ、カセット式変異誘発、部位特異的突然変異、または、当技術分野で周知である他の技術を含む方法を利用することができる（例えば、ＳｔｒｉｚｈｏｖらＰＮＡＳ ９３巻：１５０１２〜１５０１７頁（１９９６年）、ＰｒｏｄｒｏｍｏｕおよびＰｅｒｌ、Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇ． ５巻：８２７〜８２９頁（１９９２年）、ＪａｙａｒａｍａｎおよびＰｕｃｃｉｎｉ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２巻：３９２〜３９８頁（１９９２年）ならびにＣｈａｌｍｅｒｓらＢｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３０巻：２４９〜２５２頁（２００１年）を参照）。
発現ベクター
好ましい実施形態では、下記成分、および本発明の改変ＢＭＰをコードする遺伝子を含む発現ベクターが調製される。様々な宿主細胞のための多種類の適当な発現ベクターおよび適する調節配列が、当技術分野で公知である。発現ベクターは、それらに限定されないが、プロモーター配列、リボゾーム結合部位、転写開始および終止配列、翻訳開始および終止配列、転写終結シグナル、ポリアデニル化シグナル、ならびに、エンハンサーまたはアクティベーター配列を含む、転写および翻訳の調節配列を含むことができる。好ましい実施形態では、調節配列には、プロモーターならびに転写開始および終止配列が含まれる。さらに、発現ベクターは追加の要素を含むことができる。例えば、発現ベクターは２つの複製系を有することができ、このように、２つの生物体で、例えば発現のためには哺乳動物または昆虫の細胞で、またクローニングおよび増幅のためには原核生物の宿主でそれが維持されることを可能にする。さらに、発現ベクターを組み込むために、発現ベクターは宿主細胞のゲノムと相同的な少なくとも１つの配列を、好ましくは、発現構築物に連なる２つの相同配列を含む。組み込まれるベクターは、ベクター内に含ませるために適当な相同配列を選択することによって、宿主細胞の特定の遺伝子座に誘導することができる。ベクターを組み込むための構築物は、当技術分野においては周知である。さらに、好ましい実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために、選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は当技術分野で周知であり、用いる宿主細胞によって異なる。発現ベクターは、自己複製型の染色体外ベクター、または宿主ゲノムに組み込まれるベクターであることができる。]
[0109] 発現ベクターは、宿主細胞からの改変ＢＭＰの分泌を提供する、分泌リーダー配列またはシグナルペプチド配列を含むことができる。タンパク質の分泌をもたらす、適する分泌リーダー配列は、当技術分野で公知である。シグナル配列は、一般的に、細胞からのタンパク質の分泌を指示する疎水性アミノ酸で構成される、シグナルペプチドをコードする。タンパク質は、増殖培地中に、または、原核生物の場合は、細胞の内外の膜の間に位置するペリプラズム間隙に分泌される。細菌での発現の場合、変異体ＢＭＰをコードする核酸に作動可能的に連結される細菌性分泌リーダー配列が、通常好まれる。]
[0110] さらに、本発明の改変ＢＭＰのプロドメインと成熟領域との間の切断部位は、切断部位がフリンなどのプロテアーゼによってより効率的に切断されるように、当技術分野で公知である技術によって改変することができる。
トランスフェクション／形質転換
改変ＢＭＰ核酸は、核酸の以降の発現に適する方法で、単独で、または発現ベクターと一緒に細胞に導入される。導入の方法は、標的細胞型によってほぼ決定される。例示的な方法には、ＣａＰＯ４沈殿、リポソーム融合（例えば、試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）またはＦｕＧｅｎｅを用いる）、エレクトロポレーション、ウイルス感染（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０１９に概説されている）、デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、直接微量注入などが含まれる。改変ＢＭＰ核酸は、宿主細胞のゲノムに安定して組み込まれることができるか、細胞質中に一時的に、または安定して存在することができる。
改変ＢＭＰの発現のための宿主
改変ＢＭＰの発現に適当な宿主細胞には、酵母、細菌、古細菌、真菌類、ならびに、哺乳動物の細胞を含む昆虫および動物の細胞が含まれる。特に興味があるのは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓなどの真菌類、ならびに、２９３（例えば、２９３−Ｔおよび２９３−ＥＢＮＡ）、ＢＨＫ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯＫ１およびＤＧ４４）、ＣＯＳ、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３などを含む哺乳動物細胞系である。（ＡＴＣＣ細胞系カタログを参照）。改変ＢＭＰは、それらに限定されないが、植物（例えばトウモロコシ、タバコおよび藻）および動物（例えばニワトリ、ヤギ、ウシ）を含む、より複雑な生物体で生成することもできる；例えば、Ｄｏｖｅ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０巻：７７７〜７７９頁（２００２年）を参照。一実施形態では、細胞は、さらに遺伝子操作すること、すなわち、改変ＢＭＰ核酸を含む発現ベクター以外の外来性の核酸を含むことができる。
発現方法
本発明の改変ＢＭＰは、改変ＢＭＰをコードする核酸を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、改変ＢＭＰの発現を誘導するかまたは引き起こすのに適当な条件下で培養することによって生成される。一時的または安定したトランスフェクション方法を用いることができる。改変ＢＭＰの発現に適当な条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって異なり、常用の実験を通して当分野の技術者によって容易に確認される。
精製
好ましい実施形態では、改変ＢＭＰは発現後に精製または単離される。標準の精製方法には、電気泳動技術、分子技術、免疫学的技術、ならびに、イオン交換、疎水性、親和性および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを含むクロマトグラフィー技術、ならびにクロマトフォーカシングが含まれる。例えば、改変ＢＭＰは、標準の抗組換え体タンパク質抗体カラムを用いて精製することができる。タンパク濃縮と併用される、限外ろ過およびダイアフィルトレーション技術も有用である。適する精製技術の一般指針については、Ｓｃｏｐｅｓ， Ｒ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ＮＹ、第３版（１９９４年）を参照。必要な精製度は所望の使用によって異なり、一部の例では、精製を必要としない。
翻訳後修飾および誘導体化
作製されると、改変ＢＭＰは共有結合的に修飾することができる。したがって、タンパク質の共有結合的および非共有結合的修飾は、本発明の範囲に含まれる。ポリペプチドの標的アミノ酸残基を、選択される側鎖または末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって、そのような修飾を改変ＢＭＰポリペプチドに導入することができる。修飾のための最適部位は、それらに限定されないが、目視検査、構造解析、配列分析および分子シミュレーションを含む様々な基準を用いて選択することができる。修飾のための部位は、プロドメインまたは成熟したドメインに位置してもよい。]
[0111] 一実施形態では、本発明の改変ＢＭＰは、少なくとも１つの元素、同位体または化合物で標識される。一般に、標識は３つの群に分類される：ａ）放射性同位体または重同位体であってよい同位体標識；ｂ）抗体または抗原であってよい免疫標識；ｃ）染色または蛍光色素。標識は、化合物の任意の位置に組み込むことができる。標識には、それらに限定されないが、ビオチン、タグ（例えば、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ）および蛍光標識（例えば、フルオレセイン）が含まれる。二機能性剤による誘導体化は、より完全に下で記載するように、例えば、抗改変型ＢＭＰ抗体を精製する方法またはスクリーニングアッセイで用いるために、改変型ＢＭＰを水不溶性支持体マトリックスまたは表面に架橋させるために有用である。一般に用いられる架橋剤には、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二機能性イミドエステル、例えば、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二機能性マレイミド、およびメチル−３−＆ｌｓｑｂ；（ｐ−アジドフェニル）ジチオ＆ｒｓｑｂ；プロピオイミデートなどの剤が含まれる。他の改変には、それぞれ対応するグルタミルおよびアスパルチル残基へのグルタミニルおよびアスパラギニル残基のアミド分解、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルもしくはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のアミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ７９〜８６頁（１９８３年））、Ｎ末端アミンのアセチル化、および任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。そのような誘導体化は、溶解性、吸収、脳血液関門を越える輸送、血清半減期などを改善することができる。あるいは、改変ＢＭＰポリペプチドの改変は、タンパク質の任意の可能な望ましくない副作用を除去または軽減することができる。そのような影響を媒介することができる部分は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．（１９８０年）で開示される。]
[0112] 改変ＢＭＰの共有結合的改変の別の型は、米国特許第４，６４０，８３５号；４，４９６，６８９号；４，３０１，１４４号；４，６７０，４１７号；４，７９１，１９２号または４，１７９，３３７号に記載の方法により、改変ＢＭＰポリペプチドを様々な非タンパク性重合体、例えば、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンの１つに連結させることを含む。当技術分野で周知であるように、ＰＥＧ連結を達成するために様々な結合化学を用いることができる。]
[0113] 別の型の改変は、改変ＢＭＰへのグリコシドの化学的または酵素的結合である。そのような方法は、当技術分野で、例えば、１９８７年９月１１日に公開のＷＯ８７／０５３３０ならびにＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ、ＣＲＣＣｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５９〜３０６頁（１９８１年）に記載されている。]
[0114] あるいは、改変ＢＭＰポリペプチドに存在する炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に達成することができる。化学的脱グリコシル技術は当技術分野で公知であり、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら、Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２５９巻：５２頁（１９８７年）およびＥｄｇｅら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１８巻：１３１頁（１９８１年）によって記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１３８巻：３５０頁（１９８７年）に記載されている、様々なエンド−およびエキソ−グリコシダーゼを用いて達成することができる。
設計されたＢＭＰの生物物理および生化学特性評価
本発明の設計されたＢＭＰは、当技術分野で公知の方法、例えばＢｉａｃｏｒｅ方法を用いて、Ｎｏｇｇｉｎなどの阻害剤へのそれらの応答によって特徴づけることができる。改変ＢＭＰは、骨形成および軟骨形成因子の評価で通常用いられる細胞ベースおよびインビボのアッセイ、例えば、アルカリホスファターゼアッセイ、骨芽細胞増殖アッセイ、骨ノジュールアッセイ、ｑＰＣＲに基づく遺伝子発現アッセイ、またはＢＭＰ−応答要素（ＢＲＥ）ルシフェラーゼアッセイを用いて特徴づけることもできる。改変ＢＭＰの生物物理的および生物化学的特性評価を、下に詳述する。
改変ＢＭＰの活性の分析
好ましい実施形態では、野生型および改変ＢＭＰの活性は、インビトロ受容体結合アッセイ、細胞ベースの活性アッセイまたはインビボ活性アッセイを用いて分析される。
受容体結合アッセイ
１つまたは複数のＢＭＰ受容体に結合する改変ＢＭＰの能力に及ぼすＮｏｇｇｉｎの影響は、受容体結合アッセイで測定することができる。例えば、ＡＬＫ−２、ＡＬＫ−３、ＡＬＫ−６、ＡｃｔＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩｂまたはＢＭＰＲＩＩへの親和性を測定することができる。適する結合アッセイには、ＥＬＩＳＡ、蛍光異方性および強度、シンチレーション近接検定（ＳＰＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ（Ｐｅａｒｃｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８巻：８１〜８９頁（１９９９年））、ＤＥＬＦＩＡアッセイ、およびＡｌｐｈａＳｃｒｃｅｅｎ（商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ；Ｂｏｓｓｅ Ｒ．（Ｉｌｌｙ Ｃ，、およびＣｈｅｌｓｋｙ Ｄ（２００２年）から市販）が含まれるが、これらに限定されない。]
[0115] 好ましい一実施形態では、Ｂｉａｃｏｒｅまたは表面プラズモン共鳴アッセイが用いられる。例えば、ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ（２００１年）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ５巻：５７２〜５７７頁を参照。一般的に、Ｂｉａｃｏｒｅ実験は、例えば、プロテインＡ誘導体化チップまたはＮＴＡチップにＢＭＰ受容体−Ｆｃ融合タンパク質を結合して、各改変ＢＭＰを分析物として試験することによって実施することができる。抗ＢＭＰ抗体をチップに結合するか、改変ＢＭＰをチップに結合して、溶解性の受容体またはＦｃ−受容体融合タンパク質を分析物として試験することも可能である。ＴＧＦ−βアイソフォームのそれらの受容体への結合を特徴づけるために、Ｂｉａｃｏｒｅ実験がこれまで用いられてきた（Ｄｅ Ｃｒｅｓｃｅｎｚｏら（２００１年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７６巻：２９６３２〜２９６４３頁；Ｄｅ Ｃｒｅｓｃｅｎｚｏら（２００３年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３２８巻：１１７３〜１１８３頁）。]
[0116] あるいは、１つまたは複数のＢＭＰ受容体への１つまたは複数の改変ＢＭＰの親和性を測定するために、プレートベースの直接結合アッセイが用いられる。この方法は、抗ＢＭＰモノクローナル抗体を用いてＢＭＰが捕捉され、次にＢＭＰ受容体−Ｆｃ融合タンパク質を用いて検出される、修正されたサンドイッチＥＬＩＳＡである。]
[0117] 受容体および阻害剤結合を特徴づけるために、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイ（Ｂｏｓｓｅ Ｒ．ら（２００２年）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅ Ｒｅｆ ＃４０６９． ｈｔｔｐ：／／ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ．ｃｏｍ／Ｎｏｔｅｓ／Ｓ４０６９−０８０２．ｐｄｆ）を用いることができる。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）は、供与体ビーズが６８０ｎｍのレーザーによって励起されて一重項酸素を放出する、ビーズベースの非放射性ルミネッセンス近接性アッセイである。一重項酸素は拡散し、受容体ビーズの表面でチオキセン誘導体と反応し、６００ｎｍでの蛍光発光をもたらす。供与体および受容体ビーズが、各々がそれぞれリガンドおよび受容体（またはリガンドおよび阻害剤）に連結されるときに起こる分子相互作用によって近接するときだけ、蛍光発光が起こる。この相互作用は、関連する受容体または阻害剤に結合する未標識の改変ＢＭＰの適当な量を加えることによって、打ち負かすことができる。]
[0118] 一実施形態では、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイは、１）第一の適するタグまたは標識によって標識される天然のＢＭＰ；２）第一のタグまたは標識に結合することができる供与体ビーズ；３）第二の適するタグまたは標識によって標識されるＢＭＰ受容体または阻害剤；４）第二のタグまたは標識に結合することができる受容体ビーズ、および５）競合者として作用する未標識の改変ＢＭＰ分子（例えば、改変ＢＭＰ−７）の様々な量を用いて実施される。供与体または受容体ビーズを、天然のＢＭＰまたはＢＭＰ受容体を特異的に認識する抗体でコーティングすること、または、受容体を供与体ビーズに、また、リガンドを受容体ビーズに結合することも可能である。代わりの実施形態では、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイは、１）第一の適するタグまたは標識によって標識されるＩ型のＢＭＰ受容体；２）第一のタグまたは標識に結合することができる供与体ビーズ；３）第二の適するタグまたは標識によって標識されるＩＩ型のＢＭＰ受容体；４）第二のタグまたは標識に結合することができる受容体ビーズ；５）天然のＢＭＰ、および６）競合者として作用する未標識の改変ＢＭＰ分子（例えば、改変ＢＭＰ−７）の様々な量を用いて実施される。Ｉ型ＢＭＰ受容体を受容体ビーズに、ＩＩ型ＢＭＰ受容体を供与体ビーズに結合することも可能である。]
[0119] 受容体および阻害剤結合を特徴づけるために、蛍光アッセイを用いることもできる。例えば、ＢＭＰ−７またはＢＭＰ−７受容体もしくは阻害剤を、蛍光染料（適する色素の例については、分子プローブカタログを参照）で標識することができる。当技術分野で公知であるように、標識分子の蛍光強度または異等方性は、別の分子との結合後に変わることがある。蛍光アッセイは、１）蛍光標識した天然のＢＭＰ（例えば、ＢＭＰ−７）、２）ＢＭＰ受容体または阻害剤、および３）競合者として作用する未標識の改変ＢＭＰ（例えば、改変ＢＭＰ−７）の様々な量を用いて実施することができる。]
[0120] さらに、受容体結合親和性を測定するために、シンチレーション近接検定（ＳＰＡ）を用いることができる。例えば、ＢＭＰ受容体−Ｆｃ融合を、プロテインＡコートＳＰＡビーズまたはフラッシュプレートに結合させ、Ｓ３５標識ＢＭＰで処理することができる。結合事象は、光の生成をもたらす。
細胞ベースの活性アッセイ
ＢＭＰは、いくつかの型の細胞の増殖および分化を促進する。ＢＭＰ活性は、例えば、ヒト骨髄由来の間葉性幹細胞（ｈＭＳＣ）、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１（マウスの頭蓋冠に由来する骨芽細胞様細胞）、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２（胚性結合組織に由来するマウス間葉性幹細胞系）、ＡＴＤＣ５（マウス胚性癌腫細胞）、Ｌ−６（ラット筋芽細胞細胞系）またはＣ２Ｃ１２（マウス筋芽細胞の細胞系）細胞のＢＭＰによって誘導される分化の測定によって監視することができる。分化は、例えば、アルシアンブルーまたはＰＮＰＰなどのアルカリホスファターゼまたは熱量測定試薬の発光レポーターを用いて監視することができる（Ｌａｖｅｒｙら、（２００８年）、ＪＢＣ、２８３巻：２０９４８〜２０９５８頁；Ａｓａｈｉｎａら（１９９６年）Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．、２２２巻：３８〜４７頁；Ｉｎａｄａら（１９９６年）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、２２２巻：３１７〜３２２頁；Ｊｏｒｔｉｋｋａら（１９９８年）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．、６２巻：２３５９〜２３６８頁；Ｃｈｅｎｇら（２００３年）Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ ９５Ａ巻：１５４４〜１５５２頁）。]
[0121] 一次細胞で活性を監視するために、ラット肢芽軟骨分化アッセイを用いることもできる。代替実施形態では、レポーター遺伝子またはキナーゼアッセイを用いることができる。ＢＭＰはＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路を活性化するので、ＧＦＰまたはルシフェラーゼなどのＳＴＡＴ応答性レポーターを含むＢＭＰ応答性細胞系を用いることができる（Ｋｕｓａｎａｇｉら（２０００年）Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ．、１１巻：５５５〜５６５頁）。例えば、腎臓細胞でのＢＭＰ活性は、細胞ベースのアッセイを用いて測定することができる。例えば、ＷａｎｇおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ（２００４年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７９巻：２３２００〜２３２０６頁を参照。
ＢＭＰ活性の動物モデル
一般的に、動物のＢＭＰ活性は、皮下注射に続く骨誘導によって測定される。好ましい実施形態では、１つまたは複数の改変ＢＭＰの活性は、ＢＭＰ応答性疾患または状態の動物モデルで測定される。例えば、腎疾患の動物モデルには、それらに限定されないが、ラット腎毒性血清腎炎モデル（Ｚｅｉｓｂｅｒｇら、２００３年）、ラット慢性シクロスポリンＡ誘発腎症モデル（Ｌｉら（２００４年）Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２８６巻：Ｆ４６〜５７頁）、マウス片側尿管閉塞モデル（Ｓｃｈａｎｓｔｒａら（２００３年）Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａｅｍｏｓｔ．、８９巻：７３５〜７４０頁）、ストレプトゾトシン誘発糖尿病ネフロパシー（Ｔａｎｅｄａら（２００３年）Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｎｅｐｈｒｏｌ．、１４巻：９６８〜９８０頁）、抗ｔｈｙ １．１ ｍＡｂおよびＨａｂｕヘビ毒誘発糸球体腎炎モデル（Ｄｉｍｍｌｅｒら（２００３年）Ｄｉａｇｎ． Ｍｏｌ． Ｐａｔｈｏｌ．、１２巻：１０８〜１１７頁）、およびラット５／６レムナント腎臓モデル（Ｒｏｍｅｒｏら（１９９９年）Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．、５５巻：９４５〜９５５頁）が含まれる。肝臓疾患の動物モデルには、それらに限定されないが、ラット胆管連結／切断モデル（Ｐａｒｋら（２０００年）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．、８７巻：２６１〜２６８頁）、ＣＣＩ４プラスエタノール誘発肝損傷（Ｈａｌｌら（１９９１年）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１２巻：８１５〜８１９頁）、ジメチルニトロソアミン誘発肝硬変（Ｋｏｎｄｏｕら（２００３年）Ｊ． Ｈｅｐａｔｏｌ．、３９巻：７４２〜７４８頁）、およびチオアセタミド誘発肝損傷（Ｍｕｌｌｅｒら（１９８８年）Ｅｘｐ． Ｐａｔｈｏｌ．、３４巻：２２９〜２３６頁）が含まれる。肺疾患の動物モデルには、それらに限定されないが、オボアルブミン誘発気道線維症（Ｋｅｎｙｏｎら（２００３年）Ｔｏｘｉｃｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１８６巻：９０〜１００頁）、ブレオマイシン誘発肺線維症（Ｉｚｂｉｃｋｉら（２００２年）Ｉｎｔ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｐａｔｈｏｌ．、８３巻：１１１〜１１９頁）、モノクロタリン誘発肺線維症（Ｈａｙａｓｈｉら（１９９５年）Ｔｏｘｉｃｏｌ． Ｐａｔｈｏｌ．、２３巻：６３〜７１頁）、および選択的照射（Ｐａｕｌｕｈｎら（２００１年）Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、１６１巻：１５３〜１６３頁）が含まれる。神経系疾患の動物モデルには、それらに限定されないが、パーキンソン病の動物モデル、例えば６−水酸化ドーパミン（６−ＯＨＤＡ）片側病巣ラットモデル、およびＭＰＴＰ誘発パーキンソン病、ＡＬＳの動物モデル、例えば突然変異体ＳＯＤ１を発現するラットまたはマウス（Ｓｈｉｂａｔａら（２００２年）Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２２巻：３３７〜３４９頁）、および、エンドセリンまたはキノリン酸の皮質内微量注入（Ｇｉｌｍｏｕｒら（２００４年）Ｂｅｈａｖ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．、１５０巻：１７１〜１８３頁）または大脳動脈閉塞（Ｍｅｒｃｈｅｎｔｈａｌｅｒら（２００３年）Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １００７巻：８９〜１００頁）によって誘発される脳卒中の動物モデルが含まれる。
製剤および投与
本発明の設計されたＢＭＰは、哺乳動物、好ましくは医薬組成物の一部としてそれを必要とするヒトへの投与のために製剤化することができる。組成物は任意の適する手段、例えば非経口的、経口的または局所的に投与することができる。設計されたＢＭＰが、所望の組織部位に、例えば注射によって局所的に投与されるか、または、例えば静脈内、皮下、筋肉内、眼窩内、眼内、心室内、頭蓋内、包内、脊椎内、くも膜内、腹腔内、口内、直腸、膣、鼻腔内もしくはエアゾール投与によって全身的に投与される場合、組成物は好ましくは水溶液を含む。哺乳動物へのその投与が哺乳動物の正常な電解質および流体容量均衡に悪影響を与えないように、溶液は、好ましくは生理的に許容される。したがって、水溶液は、例えば、正常な生理食塩液（０．９％ＮａＣｌ、０．１５Ｍ）、ｐＨ７〜７．４を含むことができる。]
[0122] 経口または非経口全身投与のための有用な溶液は、例えば「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｇｅｎｎａｒｏ， Ａ．編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．、１９９０年、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載の、医薬分野で周知である方法のいずれかによって調製することができる。製剤は、例えば、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物起源の油、水素化ナフタレンなどを含むことができる。特に直接投与のための製剤は、グリセロール、および他の高粘度組成物を含むことができる。例えば、ヒアルロン酸、コラーゲン、リン酸三カルシウム、ポリブチレート、ポリ乳酸、ポリグリコリドおよびラクチド／グリコリド共重合体を含む、生体適合性の、好ましくは生体再吸収性重合体は、設計されたＢＭＰのインビボでの放出を制御する有用な賦形剤であることができる。本発明の設計されたＢＭＰのための他の潜在的に有用な非経口送達系は、エチレン酢酸ビニル共重合体粒子、浸透ポンプ、移植可能な注入系およびリポソームを含むことができる。吸入投与のための製剤は、賦形剤として、例えば乳糖を含有することができ、または、例えば、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココール酸またはデオキシコール酸を含む水溶液、または、点鼻の形での投与のため、もしくは鼻腔内適用されるゲルとしての油性溶液であってよい。]
[0123] あるいは、本明細書で記載されるように特定された、設計されたＯＰ−１／ＢＭＰ−７を含む設計されたＢＭＰは、経口投与することができる。例えば、設計されたＢＭＰの液体製剤は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（上記）に記載のものなどの、標準の慣行によって調製することができる。次に、投与のために、そのような液体製剤を飲料または別の補助食品に加えることができる。これらの液体製剤のエアゾールを用いて、経口投与を達成することもできる。あるいは、当技術分野で認められた乳化剤を使用して調製された固体製剤は、経口投与に適する錠剤、カプセルまたはロゼンジに形成することができる。]
[0124] 任意選択で、設計されたＢＭＰは、所望の組織による類似体の取込みを増強するための手段を含む組成物に製剤化することができる。例えば、哺乳動物で全身的に提供される場合、テトラサイクリンおよびジホスホン酸（ビスホスホネート）は、骨ミネラルに、特に骨再形成のゾーンに結合することが公知である。したがって、そのような成分は、骨組織への本発明の設計されたＢＭＰの送達を高めるために用いることができる。あるいは、細胞表面抗原などの、所望の標的組織に特異的に結合するアクセス可能な物質に特異的に結合する抗体またはその一部を用いることもできる。所望により、そのような特異的ターゲティング分子は、例えば化学架橋によって、または標準の遺伝子工学技術を用いて本発明の類似体に共有結合で結合させ、例えば、Ａｓｐ−Ｐｒｏ結合などの酸不安定結合を形成することができる。有用なターゲティング分子は、例えば、米国特許第５，０９１，５１３号の教示によって設計することができる。]
[0125] 設計されたＢＭＰのいくつかは、担体マトリックス、すなわち、不溶性ポリマーマトリックスと組み合わせたとき、最も高いレベルの活性をインビボで示すことができることも企図される。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，２６６，６８３号を参照。現在好ましい担体マトリックスは、性質が異種性、同種異系または自原性である。しかし、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ酪酸、それらの誘導体および共重合体を含む合成材料を、適する担体マトリックスを生成するために用いることもできることが企図される。好ましい合成および天然由来のマトリックス物質、それらの調製、本発明の設計されたＢＭＰでそれらを製剤化する方法、および投与の方法は当技術分野で周知であり、したがって本明細書で詳細には述べない。例えば、米国特許第５，２６６，６８３号を参照。]
[0126] さらに、本発明の設計されたＢＭＰは、単独で、または組織形態形成に対する有益な作用を有することが公知である別の物質と一緒に、それを必要とする哺乳動物に投与することができる。そのような物質（本明細書で、コファクター）の例には、組織の修復および再生を促進し、および／または炎症を阻害する物質が含まれる。骨粗しょう症個体で骨組織増殖を刺激する有用なコファクターの例には、例えば、ビタミンＤ３、カルシトニン、プロスタグランジン、副甲状腺ホルモン、デキサメタゾン、エストロゲンおよびＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩが含まれるが、これらに限定されない。神経組織の修復および再生のための有用なコファクターには、神経成長因子を含めることができる。他の有用なコファクターには、防腐剤、抗生物質、抗ウイルス薬および抗かび剤、鎮痛薬および麻酔薬を含む症状緩和コファクターが含まれる。]
[0127] 好ましくは、改変ＢＭＰは、薬学的に許容される、無毒性賦形剤および担体と混合されて、医薬組成物に製剤化される。上記のように、そのような組成物は、全身投与、例えば非経口投与のために、特に液体溶液もしくは懸濁液の形で；経口投与のために、特に錠剤もしくはカプセルの形で；または、鼻腔内に、特に粉末、点鼻薬もしくはエアゾールの形で調製することができる。組織表面への接着が望まれる場合、組成物は、フィブリノーゲン−トロンビン分散剤、または他の生体接着剤、例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ ＵＳ９１／０９２７５に開示されているものを含むことができる。次に、組成物を所望の組織表面に塗るか、噴霧するか、さもなければ塗布することができる。]
[0128] 組成物は、治療有効量、例えば、所期の効果を誘導するのに十分な時間、標的組織に設計されたＢＭＰの適当な濃度を提供する量で、ヒトまたは他の哺乳動物への非経口または経口の投与のために製剤化することができる。好ましくは、本発明の組成物は、モルフォゲン関連生物反応、例えば組織特異機能の維持または老齢化組織（例えば、骨減少性骨組織）への組織特異表現型の復帰に対する哺乳動物の必要性を緩和または軽減する。]
[0129] 当分野の技術者によって理解されるように、治療組成物中の記載される化合物の濃度は、投与される薬剤の投薬量、使用される化合物の化学特性（例えば、疎水性）および投与経路を含む、いくつかの因子によって異なる。また、投与される薬剤の好ましい投薬量は、疾患のタイプおよび程度、組織喪失または欠陥、特定患者の全体的健康状態、選択される化合物の相対的な生物学的効力、化合物の製剤、製剤中の賦形剤の存在および種類、ならびに投与経路などの変数によっておそらく決まる。一般に、本発明の化合物は、非経口投与のために約０．１〜１０ｗ／ｖ％の化合物を含む水性生理的緩衝溶液で提供することができる。一般的な用量範囲は、１日につき体重１ｋｇあたり約１０ｎｇ〜約１ｇであり、好ましい用量範囲は、体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。
治療使用
本発明の改変ＢＭＰは、骨および軟骨の形態形成の発達カスケードを誘導することができる。したがって、本発明の改変ＢＭＰは、体の様々な場所での骨および軟骨の増殖を誘導するために用いることができる。例えば、膝、肘、足首および指関節などの関節の修復が、本発明によって企図される。例えば、本発明の改変ＢＭＰは、関節炎または他の軟骨変性疾患の罹患患者で、軟骨を再生するために指示される。さらに、本発明の改変ＢＭＰは、損傷による軟骨の裂傷を治療するために指示される。さらに、本発明の改変ＢＭＰは、患者で骨増殖を誘導するのに有用である。例えば、本発明の改変ＢＭＰは、骨折もしくは骨の切断、骨粗しょう症の患者、または脊椎固定が必要な患者の治療での使用、または、脊柱、脊椎などの修復のために指示される。]
[0130] 本発明の改変ＢＭＰは、哺乳動物での骨または骨軟骨と異なる様々な組織のために、骨形態形成および組織形態形成の発達カスケードを誘導することができる。この形態形成活性は、前駆体細胞の増殖および分化を誘導する能力、ならびに、骨、軟骨、非無機物化骨格もしくは結合組織、および他の成体組織の形成をもたらす事象の進行を通して、分化表現型を支持および維持する能力を含む。]
[0131] 例えば、本発明の改変ＢＭＰは、代謝性骨疾患において、骨質量の減損を予防し、および／またはそれを増加させるための治療に用いることができる。骨形成タンパク質を用いて代謝性骨疾患で骨質量の減損を予防し、および／またはそれを増加させるための治療の一般方法は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６７４，８４４号で開示される。本発明の改変ＢＭＰは、骨切断、骨折および軟骨裂傷などの損傷部位で骨または軟骨を置換または修復するために投与することもできる。本発明の改変ＢＭＰは、歯周組織再生のために用いることができる。骨形成タンパク質を用いる歯周組織再生のための一般方法は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７３３，８７８号で開示される。本発明の改変ＢＭＰは、肝再生のために用いることができる。骨形成タンパク質を用いる肝再生のための一般方法は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８４９，６８６号で開示される。本発明の改変ＢＭＰは、慢性腎不全の治療ために用いることができる。骨形成タンパク質を用いる慢性腎不全の治療のための一般方法は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，８６１，４０４号で開示される。本発明の改変ＢＭＰは、中枢神経系虚血または外傷の後の機能回復の強化のために用いることができる。骨形成タンパク質を用いる、中枢神経系虚血または外傷の後の機能回復の強化のための一般方法は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，４０７，０６０号で開示される。本発明の改変ＢＭＰは、樹状成長の誘導のために用いることができる。骨形成タンパク質を用いる樹状成長の誘導のための一般方法は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，９４９，５０５号で開示される。本発明の改変ＢＭＰは、神経細胞接着の誘導のために用いることができる。骨形成タンパク質を用いる神経細胞接着の誘導のための一般方法は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，８００，６０３号で開示される。本発明の改変ＢＭＰは、パーキンソン病の治療および予防のために用いることができる。骨形成タンパク質を用いるパーキンソン病の治療および予防のための一般方法は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，５０６，７２９号で開示される。上記の様々な治療使用のために本発明の改変ＢＭＰを用いて一般方法を改変することは、当分野の技術者の技術の範囲内である。本発明の改変ＢＭＰの治療適用の例示的な実施形態を、下で詳しく記載する。]
[0132] 本発明の改変ＢＭＰは、病気の、または損傷を受けた哺乳動物組織の修復のために用いることができる。好ましくは修復する組織を評価し、必要に応じて、過剰な壊死性または妨害する瘢痕組織を、医学分野で公知である外科的、化学的、切断的または他の方法によって除去する。次に、改変ＢＭＰを、無菌の生体適合性組成物の一部として、外科的移植または注射によって組織部位に直接提供することができる。あるいは、改変型ＢＭＰによって刺激された前駆体細胞を含む無菌の生体適合性組成物を、組織部位に提供することができる。病気であるか損傷された、その部位の既存の組織は、前駆体細胞の増殖および組織特異分化を可能にするのに適当なマトリックスを提供する。さらに、損傷されたまたは病気の組織部位、特に外科的手段によってさらに損傷を受けたものは、形態形成的に寛容な環境を提供する。一部の組織については、改変ＢＭＰの全身的供給が十分であることが想定される。]
[0133] 場合により、特に組織損傷が多大な場合、組織は細胞流入および増殖のために十分なマトリックスを提供することができないかもしれない。これらの例では、下で記載の手段のいずれかによって調製される、適する生体適合性製剤化マトリックスと一緒に、改変ＢＭＰまたは改変型ＢＭＰによって刺激された前駆体細胞を組織部位に提供することが必要であろう。好ましくはマトリックスは組織特異的で、インビボで生物分解性であり、７０〜８５０μｍ、最も好ましくは１５０〜４２０μｍの範囲の寸法を有する粒子を含む。]
[0134] 本発明の改変ＢＭＰは、損傷の後の瘢痕組織形成を予防するか、実質的に阻害するために用いることもできる。改変ＢＭＰが新しい損傷組織部位に提供される場合、それはその部位で組織形態形成を誘導することができ、非分化結合組織へ移動する線維芽細胞の集合を阻止する。好ましくは、改変ＢＭＰは、損傷の５時間以内に組織部位に注入される無菌の医薬用製剤として提供される。]
[0135] 例えば、改変ＢＭＰは、部分肝切除の後の、かなり傷ついた肝臓組織のタンパク質誘発形態形成のために用いることができる。この一般的なプロトコルの変形形態を、他の組織のために用いることができる。一般的な方法は、組織の基本的に非再生性の部分を切り取り、改変ＢＭＰを、好ましくは溶解性の医薬用製剤として切り取られた組織部位へ提供し、創傷を閉じ、その部位を後日調べることを含む。骨と同様に、肝臓は、胎児後の生命で損傷後に再生する能力を有する。]
[0136] 別の例として、本発明の改変ＢＭＰは、象牙質形成を誘導するために用いることもできる。今まで、損傷に対する歯髄組織の予測不能な応答は、歯科において基本的な臨床上の問題である。標準の歯科外科的手順を用いて、試料歯の歯髄の真上のエナメルおよび象牙質を（ドリリングによって）除去し、歯冠歯髄組織の部分切断を実施し、止血、歯髄治療の適用を誘導し、標準手順によって空洞を密封、充填することによって、歯髄の小さな領域（例えば、２ｍｍ）を外科的に曝露させることができる。]
[0137] 別の例として、中枢神経系（ＣＮＳ）修復に対する改変型ＢＭＰによって誘導される再生的影響は、ラット脳穿刺モデルを用いて評価することができる。簡潔に、雄のＬｏｎｇ Ｅｖａｎｓラットを麻酔し、頭部領域を手術のために調製する。標準の外科的手順を用いて頭蓋冠を露出させ、０．０３５Ｋワイヤーを用い、各葉の中心に向かって頭蓋冠を丁度突き通す穴をあけた。次に改変ＢＭＰまたはＰＢＳを含む２５μｌの溶液を、ハミルトン注射器によって各穴に提供する。表面から約３ｍｍ下の深さの、下にある皮質、脳梁および海馬に溶液を送達する。次に皮膚を縫合し、動物を回復させる。]
[0138] 手術から３日後、ラットを断頭によって屠殺し、区分けのためにそれらの脳を処理する。瘢痕組織形成は、グリア瘢痕のためのマーカータンパク質であるグリア原線維酸性タンパク質の免疫蛍光染色によって評価し、瘢痕形成の程度を定性的に測定する。]
[0139] （実施例１）
アルカリホスファターゼ活性のＢＭＰ誘導
ラット骨肉腫細胞系ＲＯＳ １７／２．８でアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を誘導するＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＧＤＦ−５およびＧＤＦ−６の能力を検査した。各成長因子を、９点用量応答において３反復で試験した。詳細には、ＲＯＳ １７／２．８細胞を、９６ウェル組織培養プレートに平板培養した。ＢＭＰ／ＧＤＦを以下の投薬量、６０００、２０００、６６６、２２２、７４、２４、８、２および０．９ｎｇ／ｍｌで細胞に加え、４８時間インキュベートした。細胞をその後溶解し、ＡＬＰ活性を誘導する成長因子の効力を、試料の平均光学濃度（ＯＤ）の非線形回帰から誘導されたＥＣ５０に基づいて評価した（図２６を参照）。] 図２６
[0140] 図２５で示すように、試験したＢＭＰのすべては頑健な活性を証明したが、ＧＤＦ−５およびＧＤＦ−６は有意に活性が低かった。試験した成長因子の中で、ＢＭＰ−６はアルカリホスファターゼ活性の誘導において最も高い効力を示し、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−５、ＧＤＦ−５およびＧＤＦ−６が続いた（最も高い効力から最も低い効力の順）。] 図２５
[0141] （実施例２）
一団の例示的なＢＭＰおよび関連タンパク質のＮｏｇｇｉｎ阻害
ＮｏｇｇｉｎによるＢＭＰ阻害は、当初、ＲＯＳ １７／２．８細胞において、当技術分野で認められるアルカリホスファターゼに基づくアッセイを用いて評価した。簡潔には、ＲＯＳ １７／２．８細胞を、９６ウェル組織培養プレートに平板培養した。ＢＭＰ−２、−４、−６および−７を、濃度を段々と高めたＮｏｇｇｉｎと混合し、室温で３０分間インキュベートした。その後、各ＢＭＰの最終濃度が５０ｎｇ／ｍｌであるように、この混合物をＲＯＳ細胞に加えた。アッセイは、３反復で実施した。対照ウェルは、Ｎｏｇｇｉｎの非存在下で各ＢＭＰ単独で処理した細胞からなった。処理後４８時間、細胞をインキュベートした。細胞をその後溶解し、ＢＭＰによって誘導されたアルカリホスファターゼ総活性を、標準のプロトコルに従って測定した。Ｎｏｇｇｉｎに対する各ＢＭＰの感受性は、阻害率で報告した。試験したＮｏｇｇｉｎ濃度の各々について、阻害率を以下の式によって計算した：
阻害率＝（（ＡＰ対照−ＡＰ Ｎｏｇｇｉｎ）／ＡＰ対照）×１００
上式で、「ＡＰ対照」は、Ｎｏｇｇｉｎを含まない対照ウェルでの平均（ｎ＝３）アルカリホスファターゼ活性であり；「ＡＰ Ｎｏｇｇｉｎ」は、Ｎｏｇｇｉｎの指示濃度で処理されたウェルでの平均（ｎ＝３）アルカリホスファターゼ活性である。]
[0142] 図１１に示すＮｏｇｇｉｎ用量反応曲線は、データを非線形回帰にあてはめることによって誘導した。次に、分析した各ＢＭＰに対応するＮｏｇｇｉｎのＩＣ５０値を計算し、結果を図１１に示す。これらの結果は、試験した４つのＢＭＰがＮｏｇｇｉｎによって差別的に阻害されることを示す。ＢＭＰ−４はＮｏｇｇｉｎ阻害に最も感受性であり、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７がそれに続き、ＢＭＰ−６が最も低感受性である（図１１および２６を参照）。ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７はＮｏｇｇｉｎ阻害に明らかに感受性であるが、ＢＭＰ−６はＮｏｇｇｉｎ阻害に著しい耐性を実証し、ＩＣ５０値は、試験した他のＢＭＰのそれより４〜１６倍高く、Ｎｏｇｇｉｎ阻害に最も低感受性であった（図１１および２６を参照）。データは、４８時間および１４４時間の時点で再現性があった。] 図１１
[0143] これらのデータは、Ａ５４９−ＢＲＥ細胞を用いる、ＢＭＰによって誘導された常用のレポーター遺伝子ルシフェラーゼアッセイ（ＲＧＡ）で確認された。簡潔には、Ｎｏｇｇｉｎ阻害へのＢＭＰの感受性は、ＢＭＰ応答要素、ＢＲＥによって誘起される蛍ルシフェラーゼ遺伝子を含むＡ５４９−ＢＲＥ細胞を用いて試験した。Ａ５４９−ＢＲＥ細胞を、９６ウェル組織培養プレートの１％ＦＢＳを含むＦ１２Ｋ培地に播種した。ＢＭＰ−２、−４、−６および−７を、濃度を段々と高めたＮｏｇｇｉｎと混合し、室温で３０分間インキュベートした。その後、各ＢＭＰの最終濃度が１５０ｎｇ／ｍｌであるように、この混合物をＡ５４９−ＢＲＥ細胞に加えた。対照ウェルは、Ｎｏｇｇｉｎの非存在下で各ＢＭＰ単独で処理した細胞からなった。処理後２４時間、細胞をインキュベートした。細胞をその後溶解し、ＢＭＰによって誘導された総ルシフェラーゼ活性は、Ｂｒｉｇｈｔ Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の推奨に従って用いて測定した。Ｎｏｇｇｉｎ阻害に対する各ＢＭＰの感受性は、阻害率で報告した。試験した各Ｎｏｇｇｉｎ濃度について、阻害率を以下の式によって計算した：
阻害率＝（（Ｌｕｃ対照−Ｌｕｃ Ｎｏｇｇｉｎ）／Ｌｕｃ対照）×１００
上式で、「Ｌｕｃ対照」は、Ｎｏｇｇｉｎを含まない対照ウェルでの平均（ｎ＝３）ルシフェラーゼ活性であり；「Ｌｕｃ Ｎｏｇｇｉｎ」は、Ｎｏｇｇｉｎの指示濃度で処理されたウェルでの平均（ｎ＝３）ルシフェラーゼ活性である。]
[0144] このアッセイでは、１５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−６の存在下で達成された最大阻害は、約２５％であった（図１２Ａ）。] 図１２Ａ
[0145] このアッセイは、試験したＢＭＰの内で、ＢＭＰ−６がＮｏｇｇｉｎによる阻害に最も低感受性であることを確認した。この結果がＲＯＳ １７．８細胞およびＡ５４９−ＢＲＥ細胞の両方で得られたことを考慮すると、ｎｏｇｇｉｎ阻害へのＢＭＰ−６の耐性は、特定の細胞型またはアッセイ系に限定されなく、むしろＢＭＰ−６の内在性の特徴である。]
[0146] ＱＰＣＲによるＢＭＰによって誘導されたＩＤ−１遺伝子の発現（図１２Ｂ）を常用の材料および方法を用いて測定した後に、類似したデータがｈＭＳＣでも得られた。このアッセイでは、Ｎｏｇｇｉｎ阻害へのＢＭＰの感受性は、ヒト骨髄由来間葉性幹細胞（ｈＭＳＣ）を用いて試験した。手短に言えば、ｈＭＳＣを４８ウェル組織培養プレートに播種した。ＢＭＰ−２、−４、−６および−７を、０．５μｇ／ｍｌまたは１／５μｇ／ｍｌのＮｏｇｇｉｎと混合し、室温で３０分間インキュベートした。その後、各ＢＭＰの最終濃度が５０ｎｇ／ｍｌであるように、この混合物をｈＭＳＣ細胞に加えた。陽性対照ウェルは、Ｎｏｇｇｉｎの非存在下で各ＢＭＰ単独で処理した細胞からなった。バックグラウンドとも呼ばれる陰性対照ウェルは、媒体単独で処理した細胞からなった。処理後２４時間、細胞をインキュベートした。細胞をその後溶解し、ポリＡ ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成した。ＢＭＰによるＩＤ−１転写産物の誘導は、７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を製造業者のプロトコルに従って用いて、定量的ＰＣＲによって測定した。データ分析のために、標準のデルタ／デルタＣｔ方法を用いた。] 図１２Ｂ
[0147] 図１２Ｂに示すように、ＮｏｇｇｉｎおよびＢＭＰ−２、−４および−７の存在下でのＩＤ−１遺伝子発現は、ＢＭＰ−２、−４および−７単独の存在下でのＩＤ−１遺伝子発現と比較して有意に減少した。対照的に、０．５μｇ／ｍｌのＮｏｇｇｉｎおよびＢＭＰ−６の存在下でのＩＤ−１遺伝子発現のレベルは、ＢＭＰ−６単独の存在下と事実上同じであった。１．５μｇ／ｍｌのＮｏｇｇｉｎおよびＢＭＰ−６の存在下でさえ、ＩＤ−１遺伝子発現はＮｏｇｇｉｎのより低い濃度よりも減少したものの、発現レベルは、なお、対照でのＩＤ−１のバックグラウンド発現のレベルの２倍以上であった。] 図１２Ｂ
[0148] （実施例３）
一次ヒト骨髄由来間葉性幹細胞における下流遺伝子のＢＭＰ−６誘導は、Ｎｏｇｇｉｎ阻害に対してより低感受性である。]
[0149] 一次ヒト骨髄由来間葉性幹細胞（ｈＭＳＣ）でのＢＭＰ−６刺激の後のシグナル伝達事象に及ぼすｎｏｇｇｉｎの影響を試験した。ＢＭＰによる刺激の後、ｈＭＳＣは、１型および２型受容体のオリゴマー化、および、ＢＭＰ標的遺伝子の転写調節をもたらすＳｍａｄ１／５／８のリン酸化を含む、シグナル伝達カスケードを開始する。]
[0150] 標準のプロトコルに従ってｎｏｇｇｉｎの存在下または非存在下で、Ｉｄ−１、Ｄｌｘ−５、Ｓｐ−７、Ｍｓｘ−２、ＡＬＰおよびｎｏｇｇｉｎ自体を含む６つのＢＭＰ標的遺伝子の転写産物のレベルを、ＢＭＰ−６またはＢＭＰ−７によって刺激された細胞での定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって比較した。詳細には、ｈＭＳＣを４８ウェル組織培養プレートに播種した。ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７を、１μｇ／ｍＬ Ｎｏｇｇｉｎと室温で３０分間インキュベートした。次に、この混合物を、ＢＭＰの５０ｎｇ／ｍＬの最終濃度までｈＭＳＣ培養物に加えた。陽性対照ウェルは、Ｎｏｇｇｉｎの非存在下で各ＢＭＰ単独で処理した細胞からなった。陰性対照ウェルは、未処理の細胞およびＮｏｇｇｉｎ単独で処理した細胞からなった。処理後２４時間、細胞をインキュベートした。細胞をその後溶解し、ポリＡ ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成した。]
[0151] ＢＭＰ−６またはＢＭＰ−７処理の後のＩｄ−１、ｄｌｘ−５、Ｓｐ−７、ｍｓｘ−２、ＡＬＰおよびＮｏｇｇｉｎの遺伝子発現の調節をｎｏｇｇｉｎの存在下または非存在下で評価し、結果を図２７Ａ〜Ｆに示す。標的遺伝子Ｉｄ−１、ｄｌｘ−５、Ｓｐ−７、ｍｓｘ−２およびｎｏｇｇｉｎについては、ＢＭＰ−７によって媒介された転写の誘導は、ｎｏｇｇｉｎによって有意に阻害された（図２７Ａ〜Ｅ）。対照的に、ｎｏｇｇｉｎは、ＢＭＰ−６によって誘導される、Ｉｄ−１、Ｄｌｘ−５、Ｓｐ−７およびｎｏｇｇｉｎの転写の誘導に有意に影響を及ぼさなかった（図２Ａ〜ＣおよびＥ）。興味深いことに、ｎｏｇｇｉｎによるｈＭＳＣ処理は、いかなるＢＭＰも存在しない場合、ＡＬＰ遺伝子発現の誘導をもたらした（図２）。この影響は、ＢＭＰ−６またはＢＭＰ−７によって拮抗された（図２Ｆ）。] 図２ 図２Ｆ
[0152] （実施例４）
Ｎｏｇｇｉｎ阻害への顕著な耐性を有するＢＭＰ−７変異体タンパク質
ＢＭＰ−６がＮｏｇｇｉｎ阻害に耐性であることを考慮すると、この特徴の原因を判断してそれを利用することは、Ｎｏｇｇｉｎに同じく耐性である他のＢＭＰの変異体を作出することを可能にするであろう。この目的のために、ＢＭＰ−６のアミノ酸配列、および、ｎｏｇｇｉｎ阻害にかなりより感受性であるその最も近いパラログ、ＢＭＰ−７を比較した。図１３は、成熟したＢＭＰ−７およびＢＭＰ−６の略図を示す。これらの２つのタンパク質は、非常に相同的である。しかし、多様なアミノ酸は、図１３に表す３つの領域、領域１〜４０、４５〜８０および９０〜１２０に分類される。ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７の成熟ペプチドの配列アラインメントは、これらの分子がそれらのアミノ末端（図１６の残基１〜４０）で最も異なることを明らかにした。成熟ペプチドの第一のシステイン以外に、１１個の残基だけがＢＭＰ−７とＢＭＰ−６の間で異なることがわかった（図１６を参照）。] 図１３ 図１６
[0153] ｎｏｇｇｉｎに対する耐性の増強を担うＢＭＰ−６残基を特定するために、アラインメントに基づき、３つのＢＭＰ−６／ＢＭＰ−７キメラを作出した（図１３を参照）。これらの差を抱えるキメラタンパク質は、ＢＭＰ−７でのその対応する部分に代わってＢＭＰ−７配列に置かれるＢＭＰ−６断片をもたらす、組換え再構築およびドメインスワッピングによって生成させた。具体的には、３つのＢＭＰ−７突然変異体タンパク質を、（１）ＢＭＰ−７のアミノ末端領域配列Ｓｅｒ１〜Ｌｙｓ４０（配列番号１の残基１〜４０）をＢＭＰ６の配列Ｓｅｒ１〜Ｌｙｓ４０（配列番号３の残基１〜４０）で（「４０−１」キメラまたは変異体と命名）（２９個のアミノ酸の差）；（２）ＢＭＰ−７の中央のアミノ酸領域配列Ｖａｌ４５〜Ａｓｎ８０（配列番号１の残基４５〜８０）をＢＭＰ−６の配列Ｖａｌ４５〜Ａｓｎ８０（配列番号３の残基４５〜８０）で（「８０−１」キメラまたは変異体と命名）（７つのアミノ酸の差）；および、（３）ＢＭＰ−７のカルボキシ末端アミノ酸領域配列Ｌｅｕ９０〜Ｓｅｒ１２０（配列番号１の残基９０〜１２０）をＢＭＰ−６の配列Ｌｅｕ９０〜Ａｓｎ１２０（配列番号３の残基９０〜１２０）で（「９０−１」キメラまたは変異体と命名）（５つのアミノ酸の差）置換することによって作製した（図１３および１６を参照）。] 図１３
[0154] 次に、一時的なトランスフェクションによって、３つのキメラをＨＥＫ−２９３Ｔ細胞で発現させた。トランスフェクトされた細胞からのならし培地（ＣＭ）を収集し、組換え体タンパク質発現について分析し、その後ｎｏｇｇｉｎ阻害に対する感受性について試験した。ヒトＢＭＰ−７成熟ペプチドに対するポリクローナル抗体を用いるウェスタンブロット分析は、ならし培地で正しく処理されたキメラを検出した。これらの３つの突然変異体構築物の中で、４０−１および８０−１はＨＥＫ−２９３Ｔ細胞で類似したレベルで発現されたが、９０−１はいくらか低いレベルで発現された。]
[0155] ３つのキメラ、ならびに、野生型ＢＭＰ−６および野生型ＢＭＰ−７を発現するプラスミドでトランスフェクトされた細胞からのならし培地を、その後、前述の通り、Ａ５４９−ＢＲＥ細胞でのレポーター遺伝子アッセイによってそれらの活性およびｎｏｇｇｉｎ阻害に対する感受性について試験した。Ｎｏｇｇｉｎ阻害への感受性は、ｎｏｇｇｉｎの３つの濃度（Ｎ１＝１００ｎｇ／ｍｌ、Ｎ２＝５００ｎｇ／ｍｌおよびＮ３＝１０００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で評価し、結果を図１４に示す。] 図１４
[0156] 予想通りに、ＢＭＰ−７は用量依存的に阻害されたが、ＢＭＰ−６はｎｏｇｇｉｎに顕著な耐性を証明した。４０−１および９０−１の活性は、野生型ＢＭＰ−７のそれに類似した程度でｎｏｇｇｉｎによって阻害された。対照的に、また、野生型ＢＭＰ−６で観察されたように、キメラ８０−１は、Ｎｏｇｇｉｎの全３つの濃度でｎｏｇｇｉｎ阻害に顕著な耐性を示した。これらの結果は、指１の一部および手首ドメインにわたる成熟ドメインの残基４５〜８０から延長するＢＭＰ−６配列が、ｎｏｇｇｉｎ耐性を付与する役割を担うことを示唆する。さらに、配列操作によってＢＭＰ−６のこの特異的特徴を異なるＢＭＰに組み入れることができることが証明された。]
[0157] ８０−１の場合に観察されたｎｏｇｇｉｎ耐性が、発現レベルの差、またはならし培地中の他の要素の存在によるという可能性を排除するために、８０−１キメラの生成をスケールアップし、生じたタンパク質をさらなる特性評価のために精製した。この実行のために、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞での８０−１の大規模トランスフェクションを実施した。ならし培地を収集し、分泌された８０−１を標準の技術で精製した。]
[0158] 次に、精製された８０−１の活性およびｎｏｇｇｉｎへの感受性を、精製された野生型ＢＭＰ−６および野生型ＢＭＰ−７と並べて比較した。濃度を段々に増加させたｎｏｇｇｉｎの存在下で、タンパク質（ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７および８０−１）の各々を１００ｎｇ／ｍｌで試験した。ｎｏｇｇｉｎの完全な用量反応曲線が、３つのタンパク質のそれぞれについて導かれ、それらを図２８に示す。予想通り、精製された８０−１キメラは、Ｎｏｇｇｉｎ阻害に対して野生型ＢＭＰ−７よりも耐性であった。キメラのｎｏｇｇｉｎ反応曲線は、ＢＭＰ−６のそれに類似し、一時的なトランスフェクションからのＣＭを用いて上で観察された知見が確認された。] 図２８
[0159] これらの結果は、Ｎｏｇｇｉｎ阻害に対する耐性を付与するのに重要な残基が、残基Ｖａｌ４５とＡｓｎ８０との間のアミノ酸配列の範囲に位置することを示す。図１６の配列アラインメントに示すように、ＢＭＰ−７およびＢＭＰ−６は、この領域において７つのアミノ酸残基が異なる。したがって、８０−１は以下のアミノ酸置換、Ｒ４８Ｑ、Ｅ６０Ｋ、Ｙ６５Ｎ、Ｅ６８Ｄ、Ａ７２Ｓ、Ｓ７７ＡおよびＹ７８Ｈを有する、天然のＢＭＰ−７の配列を有する。] 図１６
[0160] さらに、これらの３つの突然変異体構築物の中で、４０−１および８０−１はＨＥＫ−２９３Ｔ細胞で類似したレベルで発現されたが、９０−１はいくらか低いレベルで発現されたことを考慮すると、８０−１突然変異体で見られる突然変異を有するようにＢＭＰ−７を突然変異させることは、ＢＭＰ−７の発現の増加を提供することができ、ＢＭＰ−７の生成を向上させるために、また最大化するためにも有用であろう。例えば、位置Ｒ４８、Ｅ６０、Ｙ６５、Ｅ６８、Ａ７２、Ｓ７７およびＹ７８の突然変異は、同じ発現系で野生型ＢＭＰ−７の発現レベルを超える、ＢＭＰ−７の高い発現に寄与することができる。また、二重、三重および四重の突然変異体、すなわち、突然変異体は位置Ｒ４８、Ｅ６０、Ｙ６５、Ｅ６８、Ａ７２、Ｓ７７およびＹ７８の２つ以上で改変を有する突然変異体も、同じ発現系で野生型ＢＭＰ−７を超える、突然変異体ＢＭＰ−７の高い発現レベルを付与することができる。例えば、位置Ｒ４８、Ｅ６０、Ｙ６５およびＡ７２で改変を有する突然変異体ＢＭＰ−７は、同じ発現系で野生型ＢＭＰ−７を超える、突然変異体ＢＭＰ−７の高い発現レベルを付与することができる。さらに、改変Ｒ４８Ａ、Ｅ６０Ｋ、Ｙ６５ＮおよびＡ７２Ｓを有する突然変異体ＢＭＰ−７は、同じ発現系で野生型ＢＭＰ−７を超える、突然変異体ＢＭＰ−７の高い発現レベルを付与することができる。]

权利要求:

請求項1
ＮｏｇｇｉｎまたはＮｏｇｇｉｎ様タンパク質による阻害に耐性であるタンパク質であって、改変骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を含み、（ａ）ヒトＢＭＰ−６の第一の置換アミノ酸Ｌｙｓ６０ならびにヒトＢＭＰ−６のＶａｌ４５、Ｇｌｎ４８、Ａｓｐ４９、Ｌｙｓ５０、Ｇｌｎ５３、Ｉｌｅ５７、Ｇｌｙ６１、Ａｌａ６３、Ａｓｎ６５、Ｔｙｒ６６、Ａｓｐ６８、Ｇｌｕ７０、Ｓｅｒ７２、Ａｓｎ７６、Ａｌａ７７、Ｈｉｓ７８、Ｍｅｔ７９およびＡｓｎ８０からなる群より選択される第二の置換アミノ酸が、野生型ＢＭＰにおける対応する位置の少なくとも２つのアミノ酸を置換し、かつ（ｂ）前記第一および第二の置換アミノ酸が、前記野生型ＢＭＰの、対応する位置の前記少なくとも２つのアミノ酸と異なるタンパク質。
請求項2
ＮｏｇｇｉｎまたはＮｏｇｇｉｎ様タンパク質による阻害に耐性であるタンパク質であって、改変骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を含み、（ａ）野生型ヒトＢＭＰ−６のＶａｌ４５〜Ａｓｎ８０が、他の点では野生型のヒトＢＭＰにおける対応するセグメントを置換し、かつ（ｂ）置換された前記対応するセグメントが、野生型ＢＭＰ−６の前記Ｖａｌ４５〜Ａｓｎ８０と同一ではないタンパク質。
請求項3
Ｄ２２Ｓ、Ｓ２４Ｑ、Ｖ２６Ｌ、Ｎ２９Ｑ、Ｖ３３Ｉ、Ｐ３６Ｋ、Ｈ３９Ａ、Ｆ４１Ｎ、Ｈ４４Ｄ、Ｐ４８Ｓ、Ａ５２Ｎ、Ｄ５３ＡおよびＬ５５Ｍからなる群より選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む改変ＢＭＰ−２タンパク質であって、一つの置換は、Ｐ３６Ｋであり、かつ他のすべての残基が、野生型ＢＭＰ−２と同一であるか、または野生型ＢＭＰ−２のＣ末端領域における保存されたシステインドメインと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
請求項4
位置Ｐ３６におけるアミノ酸置換を含む改変ＢＭＰ−２タンパク質であって、前記改変ＢＭＰ−２は、野生型ＢＭＰ−２のＣ末端領域における保存されたシステインドメインと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
請求項5
Ｄ２４Ｓ、Ｓ２６Ｑ、Ｖ２８Ｌ、Ｎ３１Ｑ、Ｖ３５Ｉ、Ｐ３８Ｋ、Ｑ４１Ａ、Ｆ４３Ｎ、Ｈ４６Ｄ、Ｄ４８Ｅ、Ｐ５０Ｓ、Ａ５４Ｎ、Ｄ５５ＡおよびＬ５７Ｍからなる群より選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む改変ＢＭＰ−４タンパク質であって、一つの置換は、Ｐ３８Ｋであり、他のすべての残基が、野生型ＢＭＰ−４と同一であるか、または野生型ＢＭＰ−４のＣ末端領域における保存されたシステインドメインと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
請求項6
Ｒ４１Ｑ、Ｅ５３ＫおよびＦ５８Ｎからなる群より選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む改変ＢＭＰ−５タンパク質であって、一つの置換は、Ｅ５３Ｋであり、他のすべての残基が、野生型ＢＭＰ−５と同一であるか、または野生型ＢＭＰ−５のＣ末端領域における保存されたシステインドメインと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
請求項7
アミノ酸置換Ｅ６０ＫならびにＲ４８Ｑ、Ｙ６５Ｎ、Ｅ６８Ｄ、Ａ７２Ｓ、Ｓ７７ＡおよびＹ７８Ｈからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む改変ＢＭＰ−７タンパク質であって、他のすべての残基が、野生型ＢＭＰ−７と同一であるか、または野生型ＢＭＰ−７のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも８９％のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
請求項8
Ｒ４８Ｑ、Ｙ６５Ｎ、Ｅ６８Ｄ、Ａ７２ＳおよびＳ７７Ａからなる群より選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む改変ＢＭＰ−７タンパク質であって、他のすべての残基が、野生型ＢＭＰ−７と同一であるか、または野生型ＢＭＰ−７のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも８９％のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
請求項9
Ｒ４８Ｑ、Ｅ６８Ｄ、Ａ７２Ｓ、Ｓ７７Ａ、Ｙ７８Ｈからなる群より選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む改変ＢＭＰ−７タンパク質であって、他のすべての残基が、野生型ＢＭＰ−７と同一であるか、または野生型ＢＭＰ−７のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも８９％のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
請求項10
アミノ酸置換Ｅ６０ＫならびにＲ４８Ｑ、Ｙ６５Ｎ、Ｅ６８Ｄ、Ａ７２Ｓ、Ｓ７７ＡおよびＹ７８Ｈからなる群より選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む改変ＢＭＰ−７タンパク質であって、他のすべての残基が、野生型ＢＭＰ−７と同一であるか、または野生型ＢＭＰ−７のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも８９％のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
請求項11
Ｒ４８Ｑ、Ｅ６０Ｋ、Ｙ６５Ｎ、Ｅ６８Ｄ、Ａ７２Ｓ、Ｓ７７ＡおよびＹ７８Ｈからなる群より選択される少なくとも３つのアミノ酸置換を含む改変ＢＭＰ−７タンパク質であって、他のすべての残基が、野生型ＢＭＰ−７と同一であるか、または野生型ＢＭＰ−７のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも８９％のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
請求項12
アミノ酸置換Ｅ６０ＫならびにＲ４８Ｑ、Ｙ６５Ｎ、Ｅ６８Ｄ、Ａ７２Ｓ、Ｓ７７ＡおよびＹ７８Ｈからなる群より選択される少なくとも３つのアミノ酸置換を含む改変ＢＭＰ−７タンパク質であって、他のすべての残基が、野生型ＢＭＰ−７と同一であるか、または野生型ＢＭＰ−７のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも８９％のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
請求項13
Ｒ４８Ｑ、Ｅ６０Ｋ、Ｙ６５Ｎ、Ｅ６８Ｄ、Ａ７２Ｓ、Ｓ７７ＡおよびＹ７８Ｈからなる群より選択される少なくとも４つのアミノ酸置換を含む改変ＢＭＰ−７タンパク質であって、他のすべての残基が、野生型ＢＭＰ−７と同一であるか、または野生型ＢＭＰ−７のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも８９％のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
請求項14
Ｎ２７Ｓ、Ｋ２９Ｑ、Ｍ３１Ｌ、Ｄ３４Ｑ、Ｌ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｅ４４Ａ、Ｆ４６Ｎ、Ｈ４７Ｙ、Ｅ４９Ｄ、Ｌ５１Ｅ、Ｅ５３Ｓ、Ｒ５７Ｎ、Ｓ５８Ａ、Ｌ６０ＭおよびＥ６１Ｎからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む改変ＧＤＦ−５タンパク質であって、他のすべての残基が、野生型ＧＤＦ−５と同一であるか、または野生型ＧＤＦ−５のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも８７％のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
請求項15
Ｎ２７Ｓ、Ｋ２９Ｑ、Ｅ３０Ｄ、Ｄ３４Ｑ、Ｌ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｅ４４Ａ、Ｙ４６Ｎ、Ｈ４７Ｙ、Ｅ４８Ｄ、Ｖ５１Ｅ、Ｄ５３Ｓ、Ｒ５７Ｎ、Ｓ５８Ａ、Ｌ６０ＭおよびＥ６１Ｎからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む改変ＧＤＦ−６タンパク質であって、他のすべての残基が、野生型ＧＤＦ−６と同一であるか、または野生型ＧＤＦ−６のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも９７％のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
請求項16
Ｄ３６Ｓ、Ｋ３８Ｑ、Ｅ３９Ｄ、Ｄ４３Ｑ、Ｌ５０Ｋ、Ｄ５１Ｇ、Ｅ５３Ａ、Ｙ５５Ｎ、Ｈ５６Ｙ、Ｅ５８Ｄ、Ｌ６０Ｅ、Ｄ６２Ｓ、Ｒ６６Ｎ、Ｓ６７Ａ、Ｌ６９Ｍ、Ｅ７０Ｎからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む改変ＧＤＦ−７タンパク質であって、他のすべての残基が、野生型ＧＤＦ−７と同一であるか、または野生型ＧＤＦ−７のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも８７％のアミノ酸配列同一性を共有する、タンパク質。
請求項17
前記タンパク質が、前記改変タンパク質の野生型ＢＭＰの対応物と比較して、ＮｏｇｇｉｎまたはＮｏｇｇｉｎ様タンパク質による生物活性阻害の低減を示す、請求項１に記載の改変骨形成タンパク質。
請求項18
請求項１に記載のタンパク質を、薬学的に許容される担体と混合されて含む医薬組成物。
請求項19
アミノ酸置換Ｒ４８ＱおよびＳ７７Ａを含む、請求項８または９に記載の改変ＢＭＰ−７。
請求項20
アミノ酸置換Ｒ４８ＱおよびＥ６０Ｋを含む、請求項７に記載の改変ＢＭＰ−７。
請求項21
アミノ酸置換Ｅ６０ＫおよびＹ６５Ｎを含む、請求項７に記載の改変ＢＭＰ−７。
請求項22
アミノ酸置換Ｒ４８Ｑ、Ｅ６０ＫおよびＳ７７Ａを含む、請求項１０に記載の改変ＢＭＰ−７。
請求項23
アミノ酸置換Ｒ４８Ｑ、Ｅ６０ＫおよびＹ６５Ｎを含む、請求項１０に記載の改変ＢＭＰ−７。
請求項24
アミノ酸置換Ｅ６０Ｋ、Ｙ６５ＮおよびＡ７２Ｓを含む、請求項１０に記載の改変ＢＭＰ−７。
請求項25
アミノ酸置換Ｒ４８Ｑ、Ｅ６０Ｋ、Ｙ６５ＮおよびＡ７２Ｓを含む、請求項１２に記載の改変ＢＭＰ−７。
請求項26
アミノ酸置換Ｌ４１Ｋを含む、請求項１４に記載の改変ＧＤＦ−５。
請求項27
アミノ酸置換Ｌ４１Ｋを含む、請求項１５に記載の改変ＧＤＦ−６。
請求項28
アミノ酸置換Ｌ５０Ｋを含む、請求項１６に記載の改変ＧＤＦ−７。
請求項29
請求項１から２８に記載のタンパク質のいずれか１つをコードする核酸。
請求項30
請求項２９に記載の核酸を含むベクター。
請求項31
請求項１から２８に記載のタンパク質のいずれか１つを、薬学的に許容される担体と混合されて含む医薬組成物。
請求項32
骨または軟骨修復が必要な患者を治療する方法であって、前記患者に請求項３１に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
請求項33
前記患者がヒトである、請求項３２に記載の方法。
請求項34
位置Ｅ６０ならびにＲ４８、Ｙ６５、Ｅ６８、Ａ７２、Ｓ７７およびＹ７８からなる群より選択される少なくとも１つの他の位置でアミノ酸置換を含む改変ＢＭＰ−７であって、ＢＭＰ−７活性を有する改変ＢＭＰ−７。
請求項35
前記位置６０の置換がＫ、Ｒ、Ｈ、ＮまたはＱ残基である、請求項３４に記載の改変ＢＭＰ−７。
請求項36
置換が位置４８で起こる、請求項３４に記載の改変ＢＭＰ−７。
請求項37
前記位置４８の置換がＱ、Ｎ、Ｗ、ＹまたはＦ残基である、請求項３６に記載の改変ＢＭＰ−７。
請求項38
置換が位置６５で起こる、請求項３４に記載の改変ＢＭＰ−７。
請求項39
前記位置６５の置換がＮ、Ｑ、Ｈ、ＫまたはＲ残基である、請求項３８に記載の改変ＢＭＰ−７。
請求項40
置換が位置６５および７２で起こる、請求項３４に記載の改変ＢＭＰ−７。
請求項41
前記位置７２の置換がＳ、Ｔ、Ｙ、ＮまたはＱ残基である、請求項４０に記載の改変ＢＭＰ−７。
請求項42
置換が位置４８、６０、６５および７２で起こる、請求項３４に記載の改変ＢＭＰ−７。
請求項43
置換が位置４８、６０および６５で起こる、請求項３４に記載の改変ＢＭＰ−７。
請求項44
置換が位置４８、６０および７７で起こる、請求項３０に記載の改変ＢＭＰ−７。